Visualizzazione e mappatura dei percorsi neuronali in una fetta di cervello dell'amigdala

Abstract

Fonte: Bosch, D., et al. Dissezione optogenetica ex vivo dei circuiti di paura nelle fette di cervello. J. Vis. Exp. (2016).

Questo video mostra una procedura per analizzare la connettività sinaptica tra la corteccia prefrontale mediale (mPFC) e i neuroni dell'amigdala utilizzando fette di cervello acuto dell'amigdala da topi. I neuroni mPFC in questi topi esprimono la canalrodopsina fusa con una proteina fluorescente. Le canalrodopsine facilitano l'afflusso di ioni e la generazione di potenziale d'azione nei neuroni mPFC dopo l'attivazione della luce. Di conseguenza, i neuroni mPFC rilasciano neurotrasmettitori che si legano ai neuroni postsinaptici dell'amigdala, innescando correnti postsinaptiche che vengono registrate per visualizzare la connettività mPFC-amigdala.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Visualizzazione e stimolazione delle fibre presinaptiche

1. Preparare il microscopio patch per l'attivazione optogenetica di fibre e cellule:
   1. Centrare il diodo a emissione luminosa (LED) montato sul percorso di erogazione della luce.
   2. Misurare l'intensità della luce LED sul piano focale posteriore e all'uscita di ciascun obiettivo con un misuratore di potenza scegliendo la lunghezza d'onda appropriata di 470 nm.
   3. Calcola l'intensità della luce in mW/mm² e crea una curva di calibrazione (intensità LED (%) rispetto all'emissione luminosa (mW/mm²)) per ciascun obiettivo per valori misurati per la lunghezza d'onda di 470 nm.
2. Recuperare una fetta acuta dell'amigdala dalla camera di interfaccia e posizionarla nella camera della fetta montata sul microscopio verticale dotato di una lampada fluorescente. Fare attenzione a posizionare la fetta in modo che la superficie della fetta rivolta verso l'alto nella camera di interfaccia sia rivolta verso l'alto anche nella camera di registrazione. Tranciare con liquido cerebrospinale artificiale fresco e ossigenato (ACSF) a una velocità di 1 - 2 ml/min a una temperatura di ~31 °C.
3. Osservare le fibre presinaptiche nella fetta utilizzando la lampada fluorescente in combinazione con set di filtri appropriati per la specifica proteina fluorescente espressa. Utilizzare l'obiettivo 5x per ottenere una panoramica (Figura 1E) e l'obiettivo 60x per la valutazione della densità delle fibre all'interno dell'area target.
   Nota: Per GFP e YFP, utilizzare il set di filtri "verde" (Eccitazione 472/20, Beamsplitter 495, Emissione 490 LP) per mCherry utilizzare il set di filtri "rosso" (Eccitazione 560/40, Beamsplitter 585, Emissione 630/70) come specificato nella tabella dei materiali/apparecchiature.
4. Aprire o limitare l'apertura nel percorso luminoso del microscopio come desiderato per l'esperimento (Figura 2D).
5. Per ottenere una registrazione del patch, riempire una pipetta del patch con la soluzione interna e montarla nel portaelettrodo. Applicare una pressione positiva sulla pipetta per cerotti e abbassarla lentamente prima nella soluzione del bagno e poi, sotto controllo visivo, nella fetta utilizzando il micromanipolatore.
   1. Avvicinarsi al neurone di interesse con la pipetta per cerotti dal lato e dall'alto. Rilasciare la pressione positiva quando la pipetta si trova sulla superficie della cella (fossetta visibile sulla superficie della cellula) e ottenere un "gigaseal" applicando una pressione negativa.
   2. Applicare un'ulteriore aspirazione per rompere il cerotto della membrana per ottenere la registrazione dell'intera cellula. Successivamente, stimolare le fibre marcate con il LED collegato utilizzando la lunghezza d'onda appropriata per l'attivazione della canalrodopsina (ChR) (470 nm) durante la registrazione delle risposte elettriche dalla cellula.
   3. Per la stimolazione sinaptica, iniziare con una bassa intensità LED e aumentare fino a raggiungere l'ampiezza di corrente sinaptica desiderata. Attivare il LED configurando le uscite digitali nel software di acquisizione dati per controllare la temporizzazione e la lunghezza dell'impulso (esempi nella Figura 3).
      Nota: è possibile utilizzare altri software e/o dispositivi di generazione TTL per attivare il LED.
6. Ripetere la stimolazione con apertura aperta o ristretta (passaggio 1.4) nel percorso luminoso del microscopio come desiderato per la successiva cellula registrata e/o in presenza di farmaci specifici.

Risultati

Figura 1. Iniezioni stereotassiche, preparazione di fette cerebrali acute e visualizzazione delle fibre presinaptiche. (A, B) Iniezione stereotassica di virus. A) Immagine di topo anestetizzato posizionato in una cornice stereotassica con il cranio esposto e la pipetta per iniezione. Riquadro: Ingrandisci l'immagine della pipetta per iniezione riempita con soluzione virale mescolata ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Liquido cerebrospinale artificiale (ACSF)	Per la composizione vedi riferimenti #16 e #23
Soluzioni patch interne	Per la composizione vedi riferimenti #16 e #23
MagnesioSolfato Eptaidrato	Roth, Germania	P027.1	preparare la soluzione madre 2M in acqua purificata
Stereoscopio, SZX2-RFA16	Olimpo, Giappone
Lampada fluorescente Xcite (XI120Q-1492)	Lumen Dynamics Group, Canada	Codice: 2012-12699
Microscopio patch, BX51WI	Olimpo, Giappone
Amplificatore patch Multiclamp 700B	Molecular Devices, Stati Uniti
Digitdata 1440A	Molecular Devices, Stati Uniti
Software PClamp, versione 10	Molecular Devices, Stati Uniti		Utilizzato per controllare l'acquisizione e la stimolazione dei dati
Regolatore di temperatura del bagno, TC05	Luigs & Neumann, Germania	200-100 500 0145
Micromanipolatore a tre assi Mini 25	Luigs & Neumann, Germania	210-100 000 0010
Controllore per micromanipolatore SM7	Luigs & Neumann, Germania	200-100 900 7311
Capillari in vetro per pipette per cerotti	World Precision Instruments, Germania	GB150F-8P
Carta da filtro in nitrato di cellulosa per camera di interfaccia	Satorius Stedim Biotech, Germania	13006--50----ACN
Unità LED, CoolLED pE	CoolLED, Regno Unito	244-1400	CoolLED o USL 70/470 e gli adattatori appropriati sono due scelte alternative per la stimolazione LED
CoolLED 100 Dual Adapt	CoolLED, Regno Unito	pE-ADAPTOR-50E
Unità LED, USL 70/470	Rapp Optoelettronico	L70-000
Adattatore a doppia porta	Rapp Optoelettronico	Informarsi con l'azienda
Set di filtri rosso (eccitazione)	AHF, Germania	F49-560	I filtri possono essere acquistati come set F46-008
(divisore di fascio)	AHF, Germania	F48-585
(emissione)	AHF, Germania	F47-630
Set di filtri verde (eccitazione)	AHF, Germania	F39-472	In alternativa: set di filtri F36-149 o F46-002 (con emissione passa-banda)
(divisore di fascio)	AHF, Germania	F43-495W
(emissione)	AHF, Germania	F76-490
LaserCheck, misuratore di potenza portatile	Coherent, Stati Uniti	1098293
Software IgorPro, versione 6	Wavemetrics, Stati Uniti		Per l'analisi dei dati elettrofisiologici, è possibile utilizzare anche altri pacchetti software alternativi
Suite neuromatica di macro per IgorPro	http://www.neuromatic.thinkrandom.com