Registrazione dell'elettroretinogramma e del potenziale evocato visivo in un ratto

Abstract

Fonte: Charng, J. et al. Impianto e registrazione dell'elettroretinogramma wireless e del potenziale evocato visivo nei ratti coscienti. J. Vis. Exp. (2016).

Questo video dimostra come registrare l'elettroretinogramma (ERG) e il potenziale evocato visivo (VEP) in un ratto cosciente. Il ratto, con elettrodi impiantati chirurgicamente, viene prima adattato al buio. Dopo aver applicato le gocce dilatanti, l'animale viene posto in un sistema di ritenuta e posizionato in una ciotola di Ganzfeld. I segnali ERG e VEP vengono quindi registrati.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione degli elettrodi

Nota: Per l'impianto chirurgico viene utilizzato un trasmettitore a tre canali, che consente di eseguire simultaneamente 2 registrazioni di elettroretinogramma (ERG) e 1 potenziale evocato visivo (VEP). I tre elettrodi attivi e i tre inattivi devono essere preformati a forma di anello prima dell'impianto per potersi attaccare all'occhio. Ai fini dell'identificazione, il produttore ha racchiuso gli elettrodi attivi in guaine di plastica semibianche e metà colorate, mentre gli elettrodi inattivi sono ricoperti da guaine colorate. L'elettrodo di terra (guaina di plastica trasparente) viene lasciato inalterato per tutti gli elettrodi attivi e inattivi per eseguire i passaggi 1.1, 1.2, 1.3 e 1.7.

1. Svitare l'elettrodo in acciaio inox a doppio filamento con due pinze a punta fine.
2. Tagliare uno dei fili in acciaio inossidabile (a circa 1 cm dalla punta), lasciando un singolo filo dritto più lungo rimasto per modellare l'elettrodo ad anello.
3. Ripiegare il singolo filo di acciaio inossidabile su se stesso e ruotarlo, formando un anello liscio sulla punta dell'elettrodo.
4. Per gli elettrodi attivi ERG, modellare questo anello ~ 0,2 - 0,5 mm di diametro ruotando la base dell'anello (per lo scopo qui descritto, modellare due elettrodi attivi in questo modo per registrare ERG da entrambi gli occhi), e per gli elettrodi ERG inattivi e VEP fare il diametro dell'anello ~ 0,8 mm di diametro (in questo esempio, eseguire questa operazione per un elettrodo VEP attivo e tutti e tre gli elettrodi inattivi).
5. Agganciare l'elettrodo attivo circolare VEP attorno a una vite in acciaio inossidabile (diametro 0,7 mm, lunghezza 3 mm) in modo che l'elettrodo poggi contro la testa della vite.
6. Agganciare i 3 elettrodi inattivi (2 ERG, 1 VEP) attorno a una seconda vite in acciaio inossidabile (diametro 0,7 mm, lunghezza 3 mm).
7. Tirare il manicotto di plastica in avanti sulle estremità affilate dei due fili di acciaio inossidabile per ridurre l'irritazione.
8. Sterilizzare i trasmettitori di telemetria immergendoli in glutaraldeide al 2% per più di 10 ore a circa 25 °C. Quindi, sciacquare il trasmettitore con soluzione fisiologica sterile tre volte.

2. Impianto del trasmettitore

1. Preparazione degli animali
   1. Disinfettare l'area chirurgica prima della sperimentazione pulendola con etanolo al 70%. Autoclavare tutte le apparecchiature chirurgiche prima dell'uso e mantenere le apparecchiature in clorexidina quando non vengono utilizzate durante l'intervento chirurgico. Coprire l'animale con un telo chirurgico durante l'intervento chirurgico per mantenere un ambiente sterile. Assicurati che tutti gli sperimentatori indossino maschere chirurgiche, guanti sterili e camici.
   2. Indurre l'anestesia con isoflurano all'1,5 - 2% a una velocità di flusso di 3 L/min e mantenerla all'1,5 - 2% a 2 L/min per tutta la durata dell'intervento. Confermare una profondità sufficiente dell'anestesia dall'assenza di un riflesso del pedale quando si pizzica il muscolo tra le dita dei piedi.
   3. Radere un'area di 40 mm x 30 mm sopra l'addome da sopra l'inguine fino allo sterno.
   4. Radere un'area di 30 mm x 20 mm sulla fronte, posteriormente agli occhi e anteriormente alle orecchie.
   5. Disinfettare le due aree rasate. Per la zona della fronte disinfettare con il 10% di iodio povidone tre volte (evitare l'uso di antisettici a base di alcol per l'area vicino all'occhio, essendo coerente con lo standard di pratica stabilito dall'Associazione dei tecnologi chirurgici). Sull'addome, disinfettare con il 10% di iodio povidone e il 70% di etanolo.
   6. Applicare 1 goccia di proxymetacaina sulla cornea per un'ulteriore anestesia topica.
   7. Applicare 1 goccia di carbossimetilcellulosa sodica sulla cornea per prevenire la secchezza degli occhi.
2. Impianto chirurgico
   1. Praticare un'incisione di 10 mm sulla testa lungo la linea mediana verticale tra le orecchie con un bisturi chirurgico.
   2. Praticare un'incisione di 5 mm sull'addome attraverso lo strato cutaneo lungo la linea mediana sotto lo sterno.
   3. Scavare una cannula di 5 mm di diametro per via sottocutanea dall'incisione dell'addome all'incisione della testa.
   4. Far passare i fili degli elettrodi (3 attivi e 3 inattivi) del trasmettitore attraverso la cannula dall'addome alla testa.
   5. Lasciare l'elettrodo di riferimento con la base del trasmettitore e coprire la punta dell'elettrodo con una garza asettica.
   6. Coprire le punte degli elettrodi (3 attivi e 3 inattivi) con una garza asettica.
   7. Fissare la testa del ratto a una piattaforma stereotassica.
   8. Estendere l'incisione della fronte a 30 mm di lunghezza con le forbici chirurgiche.
   9. Esporre l'area chirurgica ritraendo la pelle flaccida con 2 punti di sutura (3 - 0) a ore ~ 3 e 9.
   10. Raschiare il periostio sovrastante il cranio usando una garza sterilizzata per esporre le suture di bregma, lambda e linea mediana.
   11. Praticare due fori attraverso il cranio alle coordinate stereotassiche attive (7 mm ventrali alla bregma, 3 mm laterali alla linea mediana) e inattive (5 mm rostrali alla bregma sulla linea mediana).
   12. Fissare gli elettrodi attivi e inattivi VEP con viti in acciaio inossidabile premontate (diametro 0,7 mm, lunghezza 3 mm) al cranio con un piccolo cacciavite a ~ 1 mm di profondità nei fori prefabbricati. Questo ancora la vite all'osso senza danneggiare il tessuto corticale sottostante.
   13. Per impiantare gli elettrodi attivi ERG, utilizzare una sutura 8 - 0 per ritrarre temporaneamente la palpebra superiore.
   14. Inserire una cannula da 16 a 21 G per via sottocutanea da dietro l'occhio fino al fornice congiuntivale superiore.
   15. Rimuovere l'ago guida.
   16. Far passare l'elettrodo attivo attraverso il catetere di plastica accorciato dalla fronte verso l'occhio. Quindi, rimuovere il catetere di plastica.
   17. Utilizzare una sutura temporanea (8 - 0), che viene infilata attraverso l'anello dell'elettrodo, per evitare che l'elettrodo si ritragga nel tunnel.
   18. Praticare un'incisione di 0,5 mm sulla congiuntiva superiore a ore 12, 1 mm dietro il limbus. Utilizzare la dissezione smussata per esporre la sclera sottostante.
   19. Impiantare una sutura 8 - 0 o 9 - 0 immediatamente dietro il limbus a metà spessore sclerale.
   20. Rimuovere la sutura temporanea dall'elettrodo attivo ERG.
   21. Ancorare l'elettrodo attivo ERG alla sutura a spessore semisclerale legando 3 nodi consecutivi, assicurandosi che la punta dell'elettrodo sia situata vicino al limbus.
   22. Chiudere il lembo congiuntivale utilizzando da 1 a 2 suture interrotte (da 8 - 0 a 9 - 0). Assicurarsi che la congiuntiva copra completamente l'elettrodo ERG per migliorare il comfort.
   23. Rimuovere la sutura retrattile palpebrale.
   24. Ripetere la procedura per l'occhio controlaterale.
   25. Applicare il gel cianoacrilato sul cranio per fissare tutte le viti inossidabili e i fili degli elettrodi. Assicurarsi che gli elettrodi attivi ERG non siano troppo stretti prima di fissarli per consentire i movimenti oculari.
   26. Chiudere la ferita alla testa utilizzando una sutura 3 - 0 non assorbibile.
   27. Ruota il roditore per esporre la zona addominale. Allungare l'incisione dermica addominale a 40 mm lungo la Linea alba con le forbici chirurgiche.
   28. Praticare un'incisione di 35 mm attraverso la parete muscolare interna per esporre la cavità addominale interna.
   29. Utilizzando due suture (3 - 0), il corpo del trasmettitore viene fissato alla parete addominale interna destra dell'animale. Evitare il contatto con il fegato.
   30. Avvolgere l'elettrodo di terra e fissarlo in questa forma con una sutura (3 - 0). Quindi, posizionalo liberamente nella cavità addominale.
   31. Chiudere il peritoneo con una sutura continua (3 - 0).
   32. Chiudere l'incisione cutanea utilizzando suture interrotte (3 - 0).
3. Assistenza post-operatoria
   1. Monitorare l'animale fino a quando non ha riacquistato una coscienza sufficiente per mantenere la decubito sternale. Alloggiare l'animale da solo dopo l'intervento.
   2. Somministrare carprofene per via sottocutanea per analgesia (5 mg/kg) una volta al giorno per 4 giorni.
   3. Aggiungere antibiotici orali profilattici (Enrofloxin, 5 mg/kg) all'acqua potabile per 7 giorni dopo l'intervento.
   4. Applicare un unguento antinfiammatorio sui siti di incisione della pelle per ridurre l'irritazione per i primi 7 giorni dopo l'intervento.

3. Condurre Registrazioni ERG e VEP in Ratti Coscienti

1. Animale scuro per 12 ore prima delle registrazioni ERG e VEP.
2. Condurre tutte le manipolazioni sperimentali in condizioni di scarsa illuminazione rossa (17,4 cd.m-2, λmax = 600 nm)
3. Applicare gocce di anestesia topica (0,5% di proxymetacaina) e di dilatazione (0,5% di tropicamide) sulla cornea.
4. Guida il roditore cosciente in un sistema di ritenuta trasparente e personalizzato.
   nota: La lunghezza di questo tubo di plastica può essere regolata per adattarsi a ratti di diverse dimensioni, con il diametro complessivo fissato a 60 mm. L'estremità anteriore del dispositivo è affusolata per ridurre al minimo il movimento della testa e contiene perforazioni per consentire la normale respirazione. Questa parte anteriore affusolata consente l'allineamento e la stabilizzazione della testa e degli occhi del ratto all'apertura della sfera di Ganzfeld. Si noti che il roditore è stato acclimatato al sistema di contenzione (da 3 a 5 occasioni) prima dell'intervento chirurgico.
5. Posiziona il roditore davanti alla ciotola Ganzfeld con gli occhi allineati con l'apertura della ciotola.
6. Accendere il trasmettitore a permanenza facendo passare un magnete entro ~ 5 cm da esso. Quindi, verificare che il trasmettitore sia acceso controllando la spia di stato a LED sulla base del ricevitore.
7. Raccogli i segnali su un intervallo di energie luminose (ad esempio, da -5,6 a 1,52 log cd.s.m²).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Bioamplificatore	STRUMENTI AGGIUNTIVI	ML 135	Amplifica i segnali ERG e VEP
Carbossimetilcellulosa sodica 1,0%	Allergan	CAS 0009000-11-7	Mantenere l'idratazione corneale durante l'intervento chirurgico
Carprofene 0,5%	Gruppo per la salute animale Pfizer	CAS 53716-49-7	Analgesia post-operatoria, somministrata con soluzione fisiologica iniettabile per il reintegro dei liquidi
Clorexadina 0,5%	Laboratori Orion	Codice 27411, 80085	Disinfezione dello strumento chirurgico
Attivatore di gel cianoacrilato	Componenti RS	473-439	Asciuga rapidamente il gel di cianoacrilato
Gel di cianocrilato	Componenti RS	473-423	Fissare le viti in acciaio inossidabile al cranio
Fresa dentale	Storz Instruments, Bausch e Lomb	E0824A	Testa di perforazione miniaturizzata di ~0,7 mm di diametro per praticare un piccolo foro nel cranio su ciascun emisfero per impiantare viti VEP
trapano	Bosch	Dremel serie 300	Trapano automatico per trapanazione
Enrofloxin	Laboratori Troy		Antibiotico profilattico post intervento chirurgico
Sfera integratrice di Ganzfeld	Soluzioni fotometriche internazionali		Stimolatore di luce progettato su misura: diametro 36 mm, apertura 13 cm
Tamponi di garza	Multigate Medical Products Pty Ltd	57-100B	Asciuga l'incisione chirurgica e la superficie del cranio esposta durante l'intervento chirurgico
Isoflurano 99,9%	Abbott Australasia Pty Ltd	CAS 26675-46-7	Nome proprietario: Isoflo(TM) Anestetico per inalazione. Anestetico per inalazione di grado farmaceutico miscelato con ossigeno gassoso per la chirurgia implantare di elettrodi VEP
Unguento Kenacomb	Aspen Pharma Pty Ltd		Per ridurre l'irritazione e il prurito della pelle dopo l'intervento chirurgico
LED Luxeon	Phillips Lighting Co.		Per la stimolazione della luce, venti LED da 5 watt e uno da 1 watt, controllati dal software Scope
Ago (macrochirurgia)	Strumenti di precisione mondiali	501959	per suturare la chirurgia addominale e della testa, utilizzato con sutura 3-0, ago per occhiere, tagliente 5/16 cerchio Misura 1, 15 mm
Porta aghi (macrochirurgia)	Strumenti di precisione mondiali	500224	Per trattenere l'ago durante la chirurgia addominale e della testa
Porta aghi (microchirurgia)	Strumenti di precisione mondiali	Codice: 555419NT	Per tenere l'ago durante la chirurgia oculare
catetere Optiva	Smiths Medical International LTD	16 o 21 g	Guida gli elettrodi attivi corneali dal cranio alla congiuntiva
Iodio povidone 10%	Sanofi-Aventis	CAS 25655-41-8	Nome proprietario: Betadine, Antisettico per preparare la pelle rasata per l'intervento chirurgico 10%, 500 ml
Sistema di acquisizione dati Powerlab	STRUMENTI AGGIUNTIVI	Visualizzazione del materiale ML 785	Acquisizione del segnale dal trasmettitore di telemetria, accoppiato al convertitore di dati di telemetria
Proxymetacaina 0,5%	Laboratori Alcon	CAS 5875-06-9	Analgesia oculare topica
Trattenuta	Fatto da Cutom		La parte anteriore del sistema di ritenuta è affusolata per ridurre al minimo il movimento della testa, la lunghezza può essere regolata per adattarsi a diverse lunghezze del ratto, il diametro complessivo è di 60 mm.
Lama Scapel	R.G. Forniture Mediche	SNSM0206	Per incisione chirurgica
Forbici (macrochirurgia)	Strumenti di precisione mondiali	501225	per tagliare i tessuti sull'abitazione e sulla fronte
Forbici (microchirurgia)	Strumenti di precisione mondiali	501232	Per sezionare la congiuntiva per l'attacco dell'elettrodo
Software per cannocchiale	STRUMENTI AGGIUNTIVI	Versione 3.7.6	Attiva contemporaneamente lo stimolo tramite il sistema ADI Powerlab e raccoglie i dati
rasoio	Oster	Dorato A5	Radere il pelo dalle aree chirurgiche
Viti a strisciamento in acciaio inox	Microelementi di fissaggio	L001.003CS304	diametro dell'albero di 0,7 mm, lunghezza di 3 mm
Fotogramma stereotassico	David Kopf	Modello 900	Uno strumento stereotassico di piccoli animali per localizzare i punti di riferimento dell'impianto sul cranio
Telo chirurgico	Forniture mediche vitali	GM29-612EE	Garantire un ambiente sterile durante l'intervento chirurgico
Sutura (macrochirurgia)	Aghi medici Ninbo	3-0	per suturare la chirurgia addominale e della testa, intrecciata di seta sterile, 60cm
Ago da sutura (microchirurgia)	Aghi medici Ninbo	8-0 o 9-0	per chirurgia oculare, tra cui, sutura dell'elettrodo alla sclera e chiusura della ferita congiuntivale, sutura in nylon, 3/8 di cerchio 1×5, 30 cm
Convertitore di dati di telemetria	Scienze dei dati internazionali	R08	Consente al segnale di telemetria di interfacciarsi con il software di raccolta dati
Matrice di scambio dati di telemetria	Scienze dei dati internazionali		Raccoglie i dati dai trasmettitori, si accoppia con il ricevitore
Ricevitore di dati di telemetria	Scienze dei dati internazionali	RPC-1	Riceve i dati di telemetria dal trasmettitore
Trasmettitore di telemetria	Scienze dei dati internazionali	F50-EEE	Trasmettitore di telemetria a 3 canali
Tropicamide 0,5%	Laboratori Alcon		Dilatazione dell'iride
Pinzette (macrochirurgia)	Strumenti di precisione mondiali	500092	Manipolare i tessuti durante la chirurgia addominale e della testa
Pinzette (microchirurgia)	Strumenti di precisione mondiali	500342	Manipolare i tessuti durante la chirurgia oculare