Registrazione elettroencefalografica delle crisi epilettiche nei ratti indotti da epilessia

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Assemblaggio del dispositivo sonda-elettrodo per microdialisi

1. Utilizzare un elettrodo a 3 canali a due torsioni (con una lunghezza di taglio di almeno 20 mm dell'elettrodo di registrazione e un elettrodo di messa a terra lungo 10 cm) e accoppiarlo a una cannula guida per preparare il dispositivo. Vedere esempi di elettrodi a 3 canali e cannula guida per dialisi nella Figura 1A-1B.
2. Rimuovere (Figura 1C) e inserire (Figura 1D) la cannula guida metallica nella cannula di plastica fittizia alcune volte prima dell'uso per facilitarne la rimozione al momento dell'interruttore per la sonda di microdialisi nell'animale.
3. Piegare due volte i fili intrecciati dell'elettrodo di registrazione (Figura 1E-1F) per allineare i fili con la cannula cieca della guida e tagliare la punta dell'elettrodo (Figura 1G) in modo che sia più lunga di 0,5 mm rispetto alla punta della cannula guida (Figura 1H) utilizzando il calibro digitale.
4. Tenete pronto il cerchietto in silicone lungo 1 mm (diametro esterno [O.D.] 2 mm, spessore 0,3 mm; Figura 1I) e inserire la punta della cannula guida e la punta degli elettrodi attorcigliati nel cerchietto di silicone utilizzando le pinzette (Figura 1J). Fissarlo sul piede del piedistallo della cannula guida con colla polimerica ad azione rapida o resina (Figura 1K). Vedere l'esempio dei dispositivi completati nella Figura 1L e nella Figura 2A.
5. Sterilizzare il dispositivo sotto la luce ultravioletta germicida (UV) per 4 ore. Capovolgere il dispositivo quattro volte in modo che ciascuno dei suoi lati sia esposto alla luce per 1 ora < / > nota: Molti elettrodi e sonde per microdialisi fatti in casa possono essere assemblati in modo simile. La testa dell'impianto per ratti sopra descritto ha le seguenti dimensioni: 7 mm di larghezza x 5 mm di profondità x 10 mm di lunghezza dalla sommità al piedistallo; La punta dell'impianto è lunga circa 11 mm, ha un diametro di 600 μm e tutto il dispositivo pesa circa 330-360 mg. Il dispositivo può essere riutilizzato due o tre volte se i) durante l'intervento chirurgico viene lasciata sul cranio una lunghezza sufficiente dell'elettrodo di terra per l'uso successivo e ii) quando l'animale viene ucciso e il dispositivo recuperato insieme al cemento dentale viene lasciato in acetone per una notte, in modo che il cemento possa essere disaggregato meccanicamente, e il dispositivo è stato nuovamente lavato e sterilizzato.

2. Chirurgia stereotassica

1. Utilizzare un apparecchio stereotassico e un supporto per clip della sonda (Figura 2B) per l'impianto del dispositivo seguendo gli standard contemporanei per gli interventi chirurgici asettici e indolori.
   1. Anestetizzare i ratti adulti di Sprague-Dawley con una miscela di ketamina/xilazina (43 mg/kg e 7 mg/kg, per via intraperitoneale [i.p.]) e fissarla sul telaio stereotassico. Aggiungere l'anestesia con isoflurano (1,4% in aria; 1,2 ml/min) all'iniezione iniziale di ketamina/xilazina in quanto consente di controllare la profondità dell'anestesia nel tempo. Rasare il pelo sulla testa dell'animale.
2. Tamponare la superficie della pelle della testa con una soluzione a base di iodio seguita da etanolo al 70% per prepararla alla chirurgia asettica.
   1. Impiantare la cannula-elettrodo guida preparata in precedenza (1,1 – 1,5) nell'ippocampo ventrale destro utilizzando le seguenti coordinate: barra nasale + 5,0 mm, A – 3,4 mm, L + 4,5 mm, P + 6,5 mm a bregma. Seguire le tecniche standard per gli interventi chirurgici stereotassici.
   2. Assicurarsi che non copra le viti di ancoraggio. Quando lo si monta sull'apparecchio stereotassico, afferrare il dispositivo per la testa della cannula di guida in quanto può essere facilmente allineata al supporto della sonda.
3. Ancorare il dispositivo al cranio con almeno quattro viti inossidabili avvitandole nell'osso del cranio (1 vite nella sinistra e 1 vite nelle placche ossee frontali destre, 1 vite nel parietale sinistro e 1 vite nelle placche ossee interparietali). Aggiungi una goccia di colla per tessuti per fissare ulteriormente ogni vite all'osso del cranio.
   1. Coprire metà delle filettature delle viti con cemento metacrilico. Favorire il legame del cemento praticando solchi poco profondi nell'osso per aumentare l'aderenza.
4. Una volta che la punta del dispositivo è posizionata nel tessuto cerebrale, attorcigliare il filo dell'elettrodo di terra attorno a 3 viti di ancoraggio. Coprire tutte le viti montate e il dispositivo con cemento dentale.
5. Monitorare gli animali durante l'intervento chirurgico e per circa 1 ora successiva fino a quando non sono in posizione verticale e si muovono all'interno della gabbia. Tienili su un tappetino riscaldante per evitare l'ipotermia. Lasciare che i ratti si riprendano per almeno 7 giorni dopo l'impianto del dispositivo.
6. Monitorare gli animali almeno una volta al giorno per 3 giorni dopo l'intervento chirurgico per segni di dolore o angoscia. Somministrare agli animali la crema antibiotica (gentamicina 0,1%) vicino al sito inciso per prevenire l'infezione e un analgesico (tramadolo 5 mg/kg, i.p.) per 3 giorni per prevenire il dolore post-operatorio.

3. Induzione dell'epilessia del lobo temporale da parte della pilocarpina e assegnazione degli animali a gruppi sperimentali

1. Dopo una settimana di recupero post-operatorio, assegnare gli animali in modo casuale ai gruppi: (i) animali di controllo che ricevono il veicolo e (ii) animali epilettici che riceveranno pilocarpina. Utilizzare un numero proporzionalmente più alto di animali per il gruppo epilettico poiché non tutti i ratti somministrati con pilocarpina svilupperanno la malattia.
2. Iniettare una dose di metilscopolamina (1 mg/kg, per via sottocutanea [s.c.]) e 30 minuti dopo, una singola iniezione di pilocarpina (350 mg/kg, i.p.) per indurre lo stato epilettico (SE). Iniettare metilscopolamina e il mezzo perdente (soluzione fisiologica) ai ratti di controllo. Utilizzare una siringa da 1 ml con ago da 25 G per tutte le somministrazioni i.p.
   1. Controllare visivamente gli animali per iniziare ad avere crisi comportamentali (muovere la vibrissa entro 5 minuti, annuire con la testa, clonare gli arti) ed entro 25 minuti per clonare continuamente tutto il corpo (SE).
3. Arrestare l'SE 2 ore dopo l'esordio per avere una mortalità di circa il 25% e un periodo medio di latenza di circa 10 giorni mediante somministrazione di diazepam (20 mg/kg, i.p.). Osservare e registrare qualsiasi comportamento convulsivo a partire immediatamente dopo l'iniezione di pilocarpina e continuare per almeno 6 ore successive.
4. Somministrare agli animali soluzione fisiologica (1 ml, i.p.) utilizzando una siringa da 1 ml con ago da 25 G e soluzione di saccarosio (1 ml, p.o.) utilizzando una siringa da 1 ml e un ago da 17 G con alimentazione flessibile per 2-3 giorni dopo l'SE per favorire il recupero della perdita di peso corporeo.
   1. Escludere dallo studio gli animali che non raggiungono il peso corporeo iniziale entro la prima settimana dopo la pilocarpina SE (ad eccezione del gruppo acuto ucciso 24 ore dopo SE, dove il follow-up del peso corporeo non è possibile).
5. Assegnare gli animali post-SE in modo casuale a diversi gruppi sperimentali (Figura 3): fase acuta (in cui la microdialisi avviene 24 ore dopo SE), latenza (7-9 giorni dopo SE), prima crisi spontanea (circa 11 giorni dopo SE) e ciclo cronico (inizia circa 22-24 giorni dopo SE, cioè circa 10 giorni dopo la prima crisi). Monitorare gli animali per l'insorgenza di convulsioni spontanee.
   nota: Utilizzare i seguenti criteri di inclusione/esclusione per ulteriori esperimenti su ratti epilettici: sviluppo di SE convulsiva entro 1 ora dalla somministrazione di pilocarpina; aumento di peso nella prima settimana dopo l'SE e il corretto posizionamento della sonda e dell'elettrodo per microdialisi.

4. Monitoraggio e analisi del comportamento epilettico

1. Monitoraggio a lungo termine del comportamento epilettico
   1. Circa 6 ore dopo la somministrazione di pilocarpina (cioè al termine dell'osservazione diretta da parte dei ricercatori), posizionare gli animali nelle gabbie domestiche pulite e avviare il monitoraggio video 24 ore su 24.
   2. Continua il monitoraggio video 24 ore su 24 fino al giorno 5, utilizzando un sistema di videosorveglianza digitale.
   3. A partire dal 5° giorno, collegare i ratti nelle loro gabbie rettangolari domestiche al sistema di registrazione EEG collegato e continuare il monitoraggio video 24 ore su 24.
   4. Impostare i parametri sull'amplificatore posizionato all'esterno della gabbia di Faraday (impostare il fattore di amplificazione su ogni canale in base alla specificità del segnale EEG di ogni singolo animale) e avviare l'acquisizione EEG osservando il segnale EEG prodotto da cavi non collegati. Utilizzare una frequenza di campionamento di 200 Hz e un filtro passa-basso impostato su 0,5 Hz.
   5. Collegare l'animale ai cavi, tenendo la testa di un animale tra due dita tese di una mano e avvitando i connettori al piedistallo dell'elettrodo usando l'altra mano libera. Inizia l'acquisizione.
      cautela: Assicurarsi che il segnale sia privo di artefatti. Gli artefatti comuni sono punte che superano di gran lunga la scala.
   6. Un giorno prima dell'esperimento di microdialisi, trasferire gli animali nel sistema EEG legato dotato di cilindri in plexiglass per la microdialisi. Scollegare gli animali dal sistema di tethering EEG nella gabbia domestica avvitando i connettori dall'elettrodo senza trattenere l'animale. Posizionare l'animale nei cilindri alti in plexiglass.

Figura 1. Preparazione passo dopo passo del dispositivo da impiantare. (A) Elettrodo a 3 canali con elettrodo di messa a terra lungo 10 cm nella sua guaina protettiva a sinistra e cannula guida per microdialisi a destra necessaria per assemblare il dispositivo. (B). L'elettrodo nudo e la cannula guida in dettaglio. Il primo passo consiste nel rimuovere (C) e inserire (D) la cannula guida metallica da e nel suo manichino di plastica alcune volte per facilitarne il rilascio una volta impiantata nella testa dell'animale. Il secondo passo consiste nel piegare due volte l'elettrodo di registrazione attorcigliato da allineare alla cannula guida per dialisi (E, F). (G) La punta dell'elettrodo deve essere tagliata in modo che sia più lunga di 0,5 mm rispetto alla punta della cannula di guida in metallo. (H) Verificare la precisione del taglio utilizzando il calibro digitale. Successivamente, è necessario utilizzare un cerchietto di silicone lungo circa 1 mm per fissare l'allineamento dell'elettrodo al piede della cannula di guida (I). (J) La fotografia che mostra come suonare l'elettrodo e guidare lo stelo della cannula. Il passaggio finale consiste nell'applicare una goccia di resina o colla sul piedistallo della cannula guida, fissandovi il cerchietto in silicone (K). (L) Dispositivo assemblato pronto per essere sterilizzato.

Figura 2. Fotografie di diversi tipi di dispositivi per microdialisi-EEG nei ratti utilizzati (A) e la fotografia del supporto della clip della sonda (B) utilizzato per impiantare questi dispositivi. (A) La cannula guida (in verde) viene sostituita da una cannula per microdialisi in genere 24 ore prima dell'esperimento. Il connettore elettrico del dispositivo (il primo a sinistra è stato utilizzato per le registrazioni descritte in questo manoscritto) consente il collegamento di fili che conducono il segnale elettrico all'amplificatore e alle apparecchiature di raccolta dati. Il dispositivo è fissato chirurgicamente al cranio di ratti anestetizzati e le registrazioni possono essere ottenute in seguito senza causare dolore o disagio nei ratti che si comportano liberamente.

Figura 3. Progettazione sperimentale. La settimana prima dell'induzione dello stato epilettico (SE), ai ratti viene impiantato il dispositivo. L'SE è indotta dalla pilocarpina e gli animali (se non dializzati e uccisi a 24 ore dopo l'SE; i ratti del gruppo acuto) vengono monitorati video per 5 giorni (linea blu), quindi monitorati con video-EEG per valutare la frequenza e la durata delle crisi nelle loro gabbie domestiche (linea verde). Per l'esperimento di microdialisi, i ratti epilettici e i rispettivi ratti di controllo non epilettici vengono trasferiti in un altro impianto EEG dotato di gabbie cilindriche nelle 24 ore precedenti la sessione di microdialisi e ancora monitorati con video-EEG (linea verde chiaro). Le linee rosse verticali rappresentano le sessioni di dialisi in diversi momenti di sviluppo della malattia epilettica. Le linee rosse orizzontali rappresentano i diversi gruppi di animali epilettici (e i rispettivi animali non epilettici), dove la freccia indica l'ultimo giorno della microdialisi e il giorno della morte dell'animale.