Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Registrazione delle risposte sinaptiche in una camera a fette di immersione
NOTA: Vedi la Tabella dei Materiali.
- Preriscaldare la soluzione di aCSF a bagnomaria a circa 28-30 °C (questo impedirà la formazione di bolle nella camera di registrazione).
- Avviare il sistema di riciclo (4-5 ml/min) e attivare il riscaldatore in linea per equilibrare il sistema per almeno 1 ora.
- Immergere per alcuni minuti un piccolo pezzo di carta per la pulizia delle lenti e una rete di nylon fissata su un filo di platino a forma di U nella camera di immersione (Figura 1).
- Rimuovere il filo di platino a forma di U.
- Spegnere il riciclaggio e posizionare una fetta sulla carta per la pulizia delle lenti.
- Posizionare immediatamente la rete portafette sopra la fetta, accendere la pompa e lasciare che la fetta si equilibri per 30 minuti senza immergere l'obiettivo nell'aCSF.
- Riempire la micropipetta borosilicata (cioè l'elettrodo di registrazione) con aCSF (resistenza del puntale: 1-2 MΩ, riempita per 1/3 con aCSF) e montarla nel supporto della pipetta.
- Posizionare l'elettrodo di stimolazione al tungsteno con isolamento epossidico testato nel supporto del manipolatore e i fili di riferimento nella camera a fette.
- Aggiungere un secondo elettrodo di riferimento alla camera e collegarlo alla presa di riferimento dell'headstage dell'elettrodo di registrazione (Figura 1A).
- Nel software di controllo dell'amplificatore, fare clic sulla casella "zero clamp mode" e procedere facendo doppio clic sulla casella "elenco dei guadagni di uscita". Scegliere un guadagno di "100", fare doppio clic sulla "casella di riepilogo del filtro passa-alto (Bessel)", scegliere "0,1 Hz" e fare doppio clic sulla "casella di riepilogo del filtro passa-basso (CA)" per scegliere "3 kHz".
- Nel software di registrazione, fare clic su "Acquisisci | Scegli un protocollo che abbia impostazioni che consentano stimolazioni episodiche e la digitalizzazione di potenziali amplificati a 10-20 kHz per 50-100 ms e che attivi automaticamente un isolatore di stimolo 10 ms dopo l'inizio di una registrazione episodica.
- Posizionare gli elettrodi di stimolazione e registrazione in linea e paralleli allo strato piramidale, ad esempio (Figura 1B e Figura 2).
- Fai clic su "Acquisisci | Modifica protocollo" e scegli la scheda "trigger" (nella finestra pop-up). Fai clic sulla casella "sorgente di attivazione" e scegli "barra spaziatrice" come sorgente di attivazione. Fare clic sul pulsante "OK". Fare clic sul pulsante "registra" per avviare l'acquisizione e notare la finestra pop-up con un pulsante di attivazione.
- Nel software dell'isolatore di stimolo, fare clic sulla casella "controllo tensione" e inserire "0". Fare clic sul pulsante "download". Fare clic sulla finestra "software di registrazione" e premere la barra spaziatrice. Ripetere questo ciclo inserendo in sequenza i valori da 1 a 8, ad esempio a passi di 1 mV nella casella "voltage control".
- Correlare l'intensità di stimolazione con i valori di pendenza fEPSP e determinare l'intensità di stimolazione necessaria per ottenere il 40% della pendenza massima di fEPSP. Fare clic sulla "casella di controllo della tensione" e inserire il valore determinato. Fare clic sul pulsante "download".
nota: Un isolatore di stimolo viene utilizzato per applicare brevi impulsi di tensione o corrente al tessuto cerebrale. Gli impulsi bifasici possono avere 100 μs per fase.
- Nel software di registrazione, fare clic sul pulsante di arresto e quindi sul menu "Acquisisci". Fare clic su "Modifica protocollo" e scegliere la scheda "trigger" nella finestra pop-up. Fare clic sulla casella della sorgente del trigger e scegliere il "timer interno" come sorgente del trigger. Fare clic sul pulsante "OK". Fare clic sul pulsante di registrazione che avvia la registrazione automatica dei potenziali di campo ogni 30 s, ad esempio. Fare clic sul pulsante "stop" dopo 30-60 minuti.
- Fare clic sul menu "Acquisisci", fare clic su "Apri protocollo", scegliere il protocollo di induzione della plasticità sinaptica desiderato e fare clic sul pulsante "OK". Fare clic sul pulsante "registra" per attivare automaticamente la stimolazione e la registrazione ad alta frequenza. Fare clic sul pulsante "stop".
nota: Nel caso di studi relativi alla plasticità sinaptica, applicare uno dei paradigmi di induzione standard per il potenziamento a lungo termine o la depressione a lungo termine dopo una registrazione basale prolungata. Esempi rappresentativi della modulazione risultante della trasmissione sinaptica sono illustrati nella Figura 4 e nella Figura 5.
- Nel software di registrazione, fare clic su "Acquisisci | Open Protocol" e scegliere lo stesso protocollo del passaggio 4.12. Fare clic sul pulsante "OK" e quindi su "registra". Continua a eseguire automaticamente le registrazioni del potenziale sul campo per 2-4 ore, ad esempio. Fare clic sul pulsante "stop" per terminare la registrazione.
- Nel caso di studi farmaceutici, applicare il composto direttamente nel serbatoio di aCSF se si desidera la somministrazione permanente del composto (Figura 3).
