Registrazioni elettrofisiologiche di preparazioni del tronco encefalico-midollo spinale da un roditore appena nato

Abstract

Fonte: Rousseau, J., et al. L'elettrofisiologia su preparazioni isolate del tronco encefalico-midollo spinale da roditori neonati consente la registrazione dell'output della rete respiratoria neurale. J. Vis. Exp. (2015).

Questo video mostra registrazioni elettrofisiologiche di preparazioni isolate del tronco encefalico-midollo spinale da roditori appena nati. Il preparato viene posto in una camera di registrazione e le esplosioni inspiratorie dal tronco encefalico vengono registrate in condizioni di ossigenazione e privazione di ossigeno utilizzando la quarta radice nervosa ventrale nel midollo spinale.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Installazione e preparazione

1. soluzioni
   1. Preparare le soluzioni madre del liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) secondo le seguenti ricette. Altre ricette con variazioni di concentrazione sono disponibili in letteratura. Conservare le soluzioni madre a 4 °C per un massimo di un mese.
      1. Soluzione salina: aggiungere 75,39 g di NaCl (129 mM finale); 2,5 g di KCl (3,35 mM finale); 0,81 g di NaH₂PO4 (0,58 mM finale); 2,33 g di MgCl₂ (1,15 mM finale); 1,85 g di CaCl₂ (1,26 mM). Sciogliere in 800 ml di acqua distillata quindi riempire fino a 1 L con acqua distillata.
      2. Soluzione di bicarbonato: aggiungere 17,65 g di NaHCO₃ (21 mM finale). Sciogliere in 900 ml di acqua distillata, quindi riempire fino a 1 L con acqua distillata. Variazioni della concentrazione di bicarbonato si tradurranno in variazioni del pH.
      3. Soluzione di glucosio: aggiungere 54,06 g di glucosio (30 mM finale). Sciogliere in 400 ml di acqua distillata, quindi riempire fino a 500 ml con acqua distillata.
   2. Preparare l'aCSF diluendo 100 ml di soluzione salina, 100 ml di soluzione di bicarbonato e 50 ml di soluzione di glucosio in 1 L di acqua distillata. Conservare a 4 °C fino al momento dell'uso.
   3. Preparare un elettrodo di vetro riscaldando e allungando un tubo di vetro fino a quando non si rompe. Carteggiare la punta prima dell'uso. L'elettrodo può essere riutilizzato più volte, purché rimanga pulito.
2. Configurazione sperimentale
   nota: I dettagli della configurazione sono presentati nella Figura 1.
   1. Accendere l'amplificatore, il media mobile, il sistema di acquisizione dati, il regolatore di temperatura e la pompa. Controllare l'amplificazione del segnale (guadagno = 10.000), la filtrazione (soglia bassa, 10 Hz; soglia alta, 5 kHz) e la frequenza di campionamento della conversione da analogico a digitale del segnale grezzo (2,5 kHz).
   2. Riempi una bottiglia con aCSF e bollezzala con carbogeno (95% O₂, 5% CO₂). Indurre un flusso di aCSF gorgogliato e riscaldato nella camera di registrazione (volume 5 ml) a 4 ml/min. Mantenere la temperatura nella camera di registrazione a 26 (± 1) °C. Il pH dovrebbe essere 7,4 in queste condizioni standard.
   3. Conservare 50 ml di aCSF a temperatura ambiente (RT) e di aCSF a bolle di carbogeno in una siringa da 50 ml vicino alla camera di dissezione.
   4. Accendi il computer e avvia il software di registrazione.

2. Dissezione

1. Pesare e determinare visivamente il sesso dell'animale (i maschi hanno una distanza ano-genitale più lunga, mentre le femmine hanno una distanza ano-genitale più corta; i genitali maschili sono spesso scuri mentre i genitali femminili sono rosa).
2. Anestetizzare i roditori appena nati con una delle seguenti opzioni: crioanestesia (immergere completamente l'animale nel ghiaccio per 4 – 5 minuti), iniezione (equitensina a 4 ml/kg) o inalazione di anestetici volatili (isoflurano o etere). Confermare un piano di anestesia adeguato dall'assenza di un riflesso di ritiro della zampa.
3. Posiziona l'animale sulla panchina, ventrale a faccia in giù. Sezionare la parte rostrale della testa coronalmente con un bisturi a livello del bregma (visibile attraverso la pelle e il cranio). Eseguire questo passaggio immediatamente dopo che l'animale è stato anestetizzato.
4. Sezionare il corpo coronalmente con un bisturi sotto i membri anteriori.
5. Rimuovere la pelle, i muscoli, i tessuti adiposi e i visceri con forbici e pinze chirurgiche e sottili. Poiché le ossa sono morbide a questa età, fai attenzione a non danneggiare il sistema nervoso. Esegui questo passaggio sul banco.
6. Posizionare il preparato nella camera di dissezione. Utilizzare l'aCSF conservato nella siringa per ossigenare il preparato. Da questo punto fino alla fine della registrazione, utilizzare un microscopio.
7. Sulla faccia dorsale del preparato, tagliare il cranio e le vertebre dalla parte rostrale a quella caudale lungo l'asse medio con forbici e pinze chirurgiche e sottili. Aprire il cranio e le vertebre tagliate per esporre il tessuto nervoso. Utilizzare l'aCSF conservato nella siringa per ossigenare il preparato.
8. Con le pinze, rimuovere la membrana aracnoidea, un tessuto sottile che ricopre la superficie del tessuto nervoso. Trattenere la pia madre e i vasi sanguigni contro il tessuto nervoso. Utilizzare l'aCSF conservato nella siringa per ossigenare il preparato.
9. Posizionare il preparato con la dorsale rivolta verso il basso e abbassare con cura il tronco encefalico e il midollo spinale tagliando i nervi e il tessuto connettivo con le forbici tenendo il preparato in posizione. È possibile anche un approccio dorsale. Mantieni le radici e i nervi il più a lungo possibile. Rimuovere le ossa per isolare il tronco encefalico e il midollo spinale. Utilizzare l'aCSF conservato nella siringa per ossigenare il preparato.
10. Rimuovere il cervelletto e le strutture rostrali rimanenti sezionandole con il bisturi. Utilizzare l'aCSF immagazzinato nell'ago per ossigenare il preparato.
11. Opzionalmente, a seconda del disegno sperimentale, rimuovere il ponte con il bisturi mediante una sezione coronale anteriore all'arteria cerebellare inferiore. Si noti che mantenere l'intero ponte rallenterà il ritmo nei ratti e lo inibirà completamente nei topi. I preparati che includono solo la parte caudale del ponte mostrano un'attività simile a quella respiratoria con una frequenza stabile alla radice C4.

3. Registrazione

1. Posizionare il preparato nella camera di registrazione, con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Fissare il preparato con degli spilli nella parte più bassa del midollo spinale e nella parte più rostrale del tronco encefalico.
2. Utilizzando una siringa collegata all'elettrodo dal suo ago, indurre una depressione nell'elettrodo (diametro della punta del vetro: 150 - 225 μm) estraendo il pistone della siringa, in modo da riempire parzialmente l'elettrodo con aCSF.
3. Utilizzando un micromanipolatore, posizionare con cura l'elettrodo vicino a una delle quarte radici ventrali. Anche altre radici ventrali potrebbero presentare un'attività simile a quella respiratoria (ad esempio, il XII nervo cranico, la radice ventrale C1).
4. Indurre una depressione nel serbatoio dell'elettrodo tramite la siringa estraendo il pistone per aspirare delicatamente la radichetta nervosa. Quindi spostare con cautela l'elettrodo per applicarlo contro il midollo spinale.
   nota: Idealmente, la dimensione della radichetta corrisponde alla dimensione dell'apertura dell'elettrodo e crea così una tenuta tra i compartimenti interno ed esterno dell'elettrodo. Poiché gli amplificatori differenziali sono comunemente usati per tali registrazioni, qualsiasi apertura tra l'interno dell'elettrodo e la camera di registrazione riduce la qualità del segnale e rende difficile l'eliminazione del rumore di fondo.
5. Avvia la registrazione.
6. Registrare il ritmo prodotto dal preparato in condizioni normossiche (ad esempio, aCSF gorgogliato con carboidrati: 95% O₂ e 5% CO₂) per almeno 20 minuti per determinare i parametri di base del preparato.
7. Cambiare la perfusione da aCSF a bolle di carbogeni ad aCSF di stimolo (cioè bollato con il 95% di N₂ e il 5% di CO₂ per lo stimolo dell'ipossia) per 15 minuti. Modificare la durata dell'esposizione a seconda del protocollo sperimentale. Registrare la durata dell'esposizione sulla registrazione e sulla scheda tecnica dell'animale. Utilizzare tubi di acciaio inossidabile tra la bombola aCSF e la camera quando possibile per evitare la diffusione del gas all'esterno del tubo.
8. Riportare la perfusione all'aCSF standard a bolle di carbogeno per almeno 15 minuti per una registrazione di recupero. Annotalo sulla registrazione e sulla scheda tecnica degli animali.
9. Terminare la registrazione.

Risultati

Figura 1. Schema riepilogativo del setup.L'aCSF a bolle viene riscaldato e inviato da una pompa nella camera di registrazione. L'eccesso di aCSF nella camera di registrazione viene aspirato da una pompa e smaltito. La camera di registrazione è collegata a terra e al termoregolatore. L'uscita dell'elettrodo viene trasmessa direttamente all'amplificatore, quindi alla media mobile e al sistema di acquis...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Sylgard	Sigma Aldrich	761036-5EA	Utilizzare sotto il cofano
NaCl	Bioshop	SOD002
Kcl	Bioshop	POC888
CaCl2	Bioshop	CCL444
MgCl2	Bioshop	MAG510
NaHCO3	Bioshop	SOB999
NaH2PO4	Bioshop	Sensore SPM306
D-glucosio	Bioshop	GLU501
Carbogen	Alessio	343-02-0006
Regolatore di temperatura	Warner Instruments, Hamden, CT, Stati Uniti	TC-324B
Elettrodo di aspirazione	A-M Systems, Everett, WA, Stati Uniti	modello 573000
Amplificatore AC differenziale	A-M Systems, Everett, WA, Stati Uniti	modello 1700
Media mobile	CWE, Ardmore, PA, Stati Uniti	modello MA-821
Sistema di acquisizione dati	Dataq Instruments, Akron, OH, Stati Uniti	modello DI-720
Software LabChart	ADInstruments, Colorado Springs, CO, Stati Uniti
Prisma sofware	Graphpad, La Jolla, CA, Stati Uniti
Camera di registrazione	Fatto in casa
base	Kanetec, Bensenville, IL, Stati Uniti
Micromanipolatore	World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, Stati Uniti	MB
base	Kanetec, Bensenville, IL, Stati Uniti	KITE-R
Pompa peristaltica	Gilson, Middleton, Wisconsin, Stati Uniti	MB
Gabbia di Faraday	Fatto in casa	MINIPULS 3
computer