Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione chirurgica
- Pulire e preparare il trasmettitore per garantire un intervento chirurgico sicuro e sterile. Rimuovere il trasmettitore dalla sua confezione antistatica e spruzzarlo o immergerlo in etanolo al 70%. Sciacquare il trasmettitore con soluzione fisiologica sterile e posizionarlo tra le spugne di cotone sterili imbevute di soluzione fisiologica sterile o tenerlo immerso in soluzione fisiologica sterile.
- Raccogliere e sterilizzare gli strumenti necessari per la chirurgia, autoclave a vapore per la sterilizzazione. Vedere la tabella dei materiali e dei reagenti per l'elenco degli strumenti chirurgici.
2. Impianto chirurgico
- Anestetizzare gli animali e mantenere l'anestesia secondo il protocollo approvato dall'IACUC. All'inizio e durante l'intervento chirurgico, controllare il riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi ogni 15 minuti. La mancanza di risposta indica un livello sufficiente di anestesia.
- Per i cuccioli, utilizzare l'anestesia con isoflurano (4%) con O2 (100%). Per gli adulti, utilizzare ketamina (100 mg/kg) con xilazina (10 mg/kg).
- Posizione fissa nel fotogramma stereotassico. Posiziona le punte delle barre auricolari nel meato uditivo. Non stringere eccessivamente le barre auricolari poiché il cranio è molto morbido nei giovani cuccioli di ratto. Fissare il cono nasale dell'anestesia.
- Mantenere l'animale al caldo durante l'intervento chirurgico posizionandolo sul termoforo impostato a 37 °C. Negli animali adulti, applicare un unguento lubrificante sugli occhi dell'animale.
- Sterilizzare il sito di incisione e mantenere il campo chirurgico sterile.
- Tamponare il cuoio capelluto con applicazioni alternate di etanolo al 70% e betadina. Inizia dal centro del cuoio capelluto e fai cerchi concentrici sempre più larghi.
- Coprire l'animale con un telo e condurre l'intervento chirurgico sull'animale drappeggiato. Mantenere il campo chirurgico sterile rivestendo il set-up chirurgico con teli sterili, spruzzare attrezzature con etanolo al 70%.
- Indossare guanti chirurgici sterili e un camice (o come richiesto dall'istituto). Per mantenere un campo sterile, utilizzare un assistente chirurgico.
- Praticare un'incisione sul cuoio capelluto dell'animale leggermente dietro gli occhi lungo la linea mediana, circa 2 cm. Prestare attenzione quando si inserisce il bisturi poiché il cranio è ancora molto morbido nei giovani cuccioli di ratto. Fai un singolo taglio in modo che l'incisione sanguini meno e guarisca più velocemente.
- Esponi il cranio. Preparare un'area pulita e asciutta per massimizzare il legame tra il trasmettitore e le ossa del cranio. Usa le clip per l'aneurisma per afferrare il cuoio capelluto.
- Allontanare delicatamente il cuoio capelluto dalla linea mediana ai quattro angoli. Cerca punti di riferimento anatomici come bregma e lambda nel cranio. Ricorda che le ossa del cranio non sono fuse negli animali a questa età. Usa l'atlante di Paxinos delle coordinate stereotassiche per trovare la posizione corretta per il foro della bava.
- Utilizzare uno strumento di tipo Dremel con una punta da trapano a bave. Creare due fori di bava nelle posizioni di registrazione desiderate con fori di diametro superiore a 300 μm. Posizionare il foro della fresa per l'elettrodo di riferimento sopra il cervelletto dietro la lambda del cranio.
- Assicurarsi che i fili del trasmettitore siano allineati con i fori delle sbavature. Se i fili degli elettrodi non sono allineati, è probabile che gli elettrodi si contaminino con la colla e si traduca in un segnale scadente. Per allineare i fili, controllare l'adattamento del trasmettitore e piegare delicatamente gli elettrodi in modo che si allineino sui siti previsti per i fori di bava.
- Tagliare gli elettrodi. Utilizzare le forbici chirurgiche per tagliare gli elettrodi alla lunghezza desiderata. La profondità dell'elettrodo è importante per il tipo di registrazione richiesta per l'esperimento (ad esempio, posizionare gli elettrodi sopra la dura madre per le registrazioni EEG o utilizzare coordinate stereotassiche per strutture cerebrali definite).
- Applicare generosamente cianoacrilato sulla base del trasmettitore per coprire l'area, assicurandosi di evitare di rivestire gli elettrodi. La colla cianoacrilica è un isolante elettrico, contaminare gli elettrodi con la colla non comporterà alcun segnale.
- Se si registra da strutture cerebrali profonde, montare il trasmettitore sul supporto della cannula e posizionarlo nel braccio stereotassico per il controllo dell'asse z. Abbassare il trasmettitore utilizzando il braccio stereotassico alla profondità appropriata e posizionare il gel cianoacrilato attorno al trasmettitore.
- Asciugare accuratamente il cranio prima di posizionare il trasmettitore per garantire un forte legame adesivo. Applicare il trasmettitore rivestito di cianoacrilato sul cranio. Fare attenzione ad allineare gli elettrodi con i fori di fresatura corrispondenti.
- Cerca di evitare di danneggiare le principali strutture vascolari. Tenere il trasmettitore in posizione esercitando una leggera pressione per un minuto. Esercitare una leggera pressione per formare un forte legame tra il trasmettitore e il cranio.
- Applicare ulteriore cianoacrilato, quanto basta per sigillare completamente l'interfaccia trasmettitore/cranio. Per garantire una buona vestibilità e un forte legame, massimizza la superficie della colla che entra in contatto con il cranio. Applicare l'adesivo cianoacrilato in un cerchio attorno al trasmettitore, assicurandosi che sia il cranio che la parete del trasmettitore siano coperti.
- Applicare l'accelerante chimico (0,1 ml) attraverso una siringa attorno al cianoacrilato alla base del trasmettitore impiantato. Utilizzare l'accelerante con parsimonia, facendo attenzione a non applicarlo sul tessuto adiacente.
nota: L'accelerazione chimica della polimerizzazione del cianoacrilato assicura che il forte legame tra il trasmettitore e il cranio si formi rapidamente. L'accelerante cianoacrilato è utile per accelerare l'indurimento dell'adesivo, ma non è necessario.
- Rimuovere l'accelerante lavando accuratamente l'area con soluzione fisiologica sterile. L'acceleratore di cianoacrilato può causare irritazione dei tessuti se non lavato dall'area dell'incisione. Per lavare l'area, riempire una siringa da 1,0 ml con soluzione fisiologica sterile e irrigare l'area attraverso un ago per siringa. In genere, 0,5 ml di soluzione fisiologica sono sufficienti per lavare via l'acceleratore.
- Suturare la pelle attorno alla base del trasmettitore, ma non coprire il trasmettitore. La parte superiore del trasmettitore deve essere sopra la pelle per trasmettere in modo efficiente i segnali neurali. La pelle deve essere ragionevolmente stretta attorno al trasmettitore e la colla attorno all'unità. Utilizzare Vicryl o sutura di seta (filo morbido); La pelle negli animali immaturi è morbida e si danneggia facilmente se non vengono utilizzate suture morbide. Per gli animali adulti, utilizzare qualsiasi materiale di sutura.
- Rimuovere l'animale dal telaio stereotassico e posizionarlo su una coperta riscaldata per il recupero.
- Assicurarsi che gli animali siano caldi (37 °C) e deambulanti (cioè completamente guariti) prima di tornare alla diga. Assicurarsi che l'animale sia idratato pizzicando la pelle sulla schiena dell'animale (se l'animale è disidratato, la pelle rimarrà deformata). Se l'animale è disidratato, somministrare un'iniezione sottocutanea del tampone di Ringer lattato. Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale.
- Somministrare buprenorfina (0,05 mg/kg) agli animali per la gestione del dolore post-chirurgico e un'iniezione sottocutanea di 0,1 ml di bupivacaina intorno al sito di iniezione.
nota: Dall'inizio alla fine, l'intera procedura dovrebbe essere completata in 5-10 minuti per gli animali di questa età (6° giorno postnatale). Il tempo chirurgico può richiedere più tempo per gli animali più anziani.
3. Cura e alloggio
Nota: Alcune dighe potrebbero non tollerare cuccioli impiantati con il dispositivo. Potrebbe essere necessario selezionare dighe tolleranti. È accettabile che la madre sposti i cuccioli all'interno della gabbia raccogliendoli dal trasmettitore.
- Una volta che gli animali sono stati svezzati, alloggiarli singolarmente per evitare la rimozione dei dispositivi dal loro compagno di gabbia.
- Sopprimere gli animali con una dose letale di pentobarbital (25 mg/kg) o isoflurano (in una campana di vetro) quando sono presenti segni di sofferenza.
- Nota: alcune gabbie per animali con inserti a filo possono interferire con i trasmettitori impiantati. Assicurarsi di controllare l'altezza dell'inserto del cavo per assicurarsi che gli animali non possano impigliare il trasmettitore tra le "barre" dell'inserto del filo.
4. Registrazione EEG
- Metti l'animale in una gabbia da solo o in co-alloggio con i compagni di cucciolata e la madre. Tuttavia, posizionare un solo animale impiantato in una singola gabbia. Non lasciare i cuccioli da soli nella camera di registrazione per più di 2 ore. Monitora gli animali per segni di angoscia e disidratazione.
- Collegare l'alimentatore in dotazione alla base del ricevitore e verificare che la spia di alimentazione sia accesa. Collegare la base del ricevitore a un sistema di acquisizione dati utilizzando cavi a baionetta Neil-Concelman (BNC).
- Posizionare la gabbia per animali sopra la base del ricevitore (Figura 1). La spia di "segnale" dovrebbe accendersi indicando che è stato rilevato un trasmettitore. I dati possono ora essere registrati.
- Per registrare i dati, collegare la base del ricevitore a un convertitore analogico/digitale e collegare il convertitore a un computer (Figura 2).
- Impostare la frequenza di campionamento della registrazione. Assicurarsi che i dati siano campionati correttamente. Selezionare una frequenza di campionamento di almeno 250 Hz (consigliata 500 Hz) per la registrazione (la larghezza di banda del trasmettitore è 0,1-100 Hz).
- Salva i dati digitalizzati e analizzali utilizzando pacchetti software di elaborazione del segnale come Matlab.
