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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Configurazione per il Taglio di Fette di Cervello
- Preparare una soluzione di taglio composta da (mM) 125 colina-Cl, 2,5 KCl, 0,4 CaCl2, 6 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 20 D-glucosio saturo di gas carbogeno (95% O2-5% CO2) e una soluzione di registrazione del liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) composta da (mM) 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 10 D-glucosio, saturo di carbogena. Mettere la soluzione di taglio sul ghiaccio per mantenerla fredda.
- Congelare circa 400 ml di soluzione di taglio e frullare insieme a 100 ml di soluzione di taglio non congelata per creare un impasto di ghiaccio. Bollare con carbogeno (95 % O2–5 % CO2) a un flusso di circa 0,5 L/min attraverso tubi di piccolo calibro o vetro sinterizzato per produrre un flusso costante ma delicato di bolle.
- Preparare un becher da 250 ml con un inserto in rete di nylon rialzato su cui verranno posizionate le fette di cervello. Riempire con aCSF per coprire la rete di circa 2 cm e bollare con carbogen, assicurandosi che le bolle non interrompano direttamente l'area di tenuta della fetta. È anche importante che non ci siano bolle d'aria nella rete di nylon, quindi se sono presenti rimuoverle. Questa sarà la camera di contenimento e sarà mantenuta a RT (20 - 25 °C).
- Disporre gli strumenti di dissezione, tra cui un grande paio di forbici, un piccolo paio di forbici, micro spatole piccole e grandi e paia di pinze grandi e piccole e raffreddarle sul ghiaccio. Posizionare il blocco per tagliare i tessuti del vibratomo sul ghiaccio su un quadrato di carta stagnola. Procurarsi 2 pezzi di carta da filtro da 6 cm, una lametta a filo singolo e un becher da 25 ml riempito con l'impasto della soluzione di taglio.
- Riempi un secondo contenitore di ghiaccio, stendine un pezzo di carta velina sul ghiaccio e posiziona sopra un piatto di coltura di 12 cm. Riempire la capsula di coltura con la soluzione di taglio, l'impasto di ghiaccio e bollire con il carbogeno. Questo è il contenitore in cui deve essere eseguita la dissezione cerebrale.
- Prepara il vibratomo. Rimuovere una lama di rasoio a doppio taglio fresca (utilizzare una lama nuova ogni volta) dal suo involucro e spruzzare con etanolo all'80%, quindi acqua deionizzata. Tagliare una pipetta di trasferimento in plastica da 3 ml nel punto in cui inizia a ridursi. Questo verrà utilizzato per trasferire fette di cervello. Piegare un ago da 27 G alla base di circa 45° e collegarlo a una siringa da 1 ml. Questo verrà utilizzato per manipolare le fette durante il taglio.
2. Tagliare le Fette di Cervello
- Anestetizzare un topo (P16-P18) con isoflurano al 2% o un metodo approvato localmente. Dopo l'induzione, decapitare l'animale con un grande paio di forbici e far cadere la testa nel piatto di coltura di 12 cm che contiene un impasto di soluzione di taglio a bolle. Il liquame deve immergere totalmente la testa per un rapido raffreddamento.
- Tenere la parte anteriore della testa con una mano, staccando la pelle e il tessuto connettivo in avanti verso il naso. Usando le piccole forbici taglia il tessuto connettivo per rivelare il cranio sottostante. Quindi rimuovere i muscoli sovrastanti l'aspetto dorsale del cranio e del collo.
- Rimuovere il cervello dal cranio fissando prima la parte anteriore del cranio con la grande pinza e poi fare due tagli laterali attraverso l'osso su entrambi i lati del forame magno usando le piccole forbici (Figura 1, tagli etichettati A1 e A2).
- Fai un altro taglio tra gli occhi (appena davanti al bregma) (Figura 1, taglio etichettato B) quindi taglia con cura lungo la sutura sagittale anteriormente e rifletti le sezioni del cranio tagliate per rivelare il cervello (Figura 1, taglio etichettato C).
- Usa la piccola spatola per estrarre il cervello e posizionarlo su un piatto di coltura. Essere consapevoli dei nervi cranici sulla parte inferiore del cervello che dovranno essere recisi, questo può essere fatto utilizzando la micro spatola di dimensioni più piccole. Usando la spatola più grande, trasferire il cervello nel becher da 25 ml riempito con l'impasto della soluzione di taglio.
- Preparazione dell'emisfero cerebrale per l'affettatura.
- Mettere un pezzo di carta da filtro da 6 cm sul fondo di un piatto di coltura fresco, quindi riempire con l'impasto e la bolla con soluzione di taglio fresca. Usa la spatola più grande per posizionare il cervello, con il lato ventrale rivolto verso il basso, sulla carta da filtro. Prendi una lama di rasoio a un taglio nuova e pulita e taglia il cervello per rimuovere il cervelletto, quindi fai un taglio lungo la linea mediana per separare il cervello in due emisferi.
- Preparazione del blocco di tessuto del vibratomo.
- Prendi il blocco di tessuto del vibratomo raffreddato, asciuga la superficie e metti una goccia di colla cianoacrilica al centro e distribuiscila uniformemente fino alla dimensione approssimativa del cervello. Usa la spatola piccola per manipolare uno degli emisferi cerebrali sulla micro spatola grande in modo che il lato mediale del cervello sia rivolto verso il basso.
- Tocca il bordo della spatola all'interfaccia del cervello sul secondo pezzo di carta da filtro per rimuovere la maggior parte della soluzione possibile. Fai scivolare il cervello fuori dalla spatola più grande usando la spatola più piccola per guidarlo sulla colla.
- Fissare il blocco di taglio nella camera del vibratomo e riempire la camera con liquame e bolle di soluzione di taglio, assicurandosi che il cervello sia completamente immerso. Ruotare il blocco di taglio in modo che il lato ventrale del cervello sia rivolto verso la lama.
- Affettare il cervello.
nota: Ogni vibratomo è unico, quindi segui le istruzioni del produttore.
- Impostare lo spessore della fetta a 450 μm e assicurarsi che la lama vibri mentre si muove attraverso il cervello a una velocità di circa 0,3 mm/s. Tagliando interamente il cervello dal lato ventrale alla superficie corticale, questo produrrà fette sagittali intere del cervello che possono essere utilizzate per registrazioni elettrofisiologiche. Le fette saranno prodotte lateralmente o medialmente e in genere 3-4 fette possono essere tagliate da ciascun emisfero.
- Se la base della fetta si solleva, usa l'ago piegato da 27 G per premere delicatamente la fetta verso il basso. Man mano che ogni fetta viene tagliata, utilizzare la pipetta di trasferimento per spostarla sulla piattaforma nella camera di contenimento, dove è vitale per un massimo di 8 ore.
3. Registrazioni di elettrofisiologia extracellulare
- Montaggio della fetta nella camera di registrazione.
- Utilizzando la pipetta di trasferimento, posizionare una fetta di cervello in una camera di registrazione sommersa perfusa con aCSF che scorre a 1 - 2 ml/min e riscaldata a 32 °C. L'aCSF utilizzato per le registrazioni differisce da quello nella camera di contenimento in quanto la concentrazione di Mg2+ viene aumentata da 2 mM a 4 mM.
- Fissare la fetta con un'"arpa" (acciaio inossidabile semicircolare con fili di nylon tesi a una distanza di 2 - 3 mm). Posizionare l'arpa in modo che i fili scorrano paralleli a CA1. Aumentare la velocità di perfusione a 8 - 10 ml/min a 32 °C.
- Al microscopio da dissezione, posizionare un elettrodo stimolante e un elettrodo di registrazione (elettrodo di vetro riempito con la soluzione di registrazione aCSF) sulla superficie dello strato radiato del CA1 (Figura 2A). Posizionare prima l'elettrodo stimolante, quindi posizionare l'elettrodo di registrazione.
- Stimolare i collaterali Schaffer con un'ampiezza di 120 - 150 μA e un impulso di test di durata di 0,1 msec e osservare la forma d'onda del potenziale post-sinaptico eccitatorio di campo (fEPSP) risultante per determinare la salute della fetta (Figura 2B). Potrebbe essere necessario spostare gli elettrodi di stimolazione e registrazione nella fetta a circa 50 - 100 μm dalla superficie della fetta per ottenere una registrazione fEPSP con una piccola raffica di fibre e una grande ampiezza. I fEPSP evocati collaterali di Schaffer sono stereotipati e forniscono un buon indicatore della salute della fetta. Le fette sane mostrano tipicamente un rapporto tra volley di fibre e ampiezza fEPSP inferiore a 0,3.
- Riposizionamento degli elettrodi.
- Utilizzando un microscopio da dissezione, spostare l'elettrodo stimolante al centro dello strato oriens e spostare l'elettrodo di registrazione sullo strato di celle piramidali il più vicino possibile all'elettrodo di registrazione, come mostrato nella Figura 3A. Potrebbe essere necessario spingere gli elettrodi di stimolazione e registrazione nella fetta di circa 50 - 100 μm in modo che l'ampiezza di risposta fEPSP all'impulso di prova di 120 - 150 μA sia di circa 1 mV.
- Generazione γ oscillazioni.
- Per generare oscillazioni γ, stimolare il tessuto con un treno di 20 impulsi da 0,1 msec erogati a 200 Hz. Questo stimolo tetanico può produrre risposte riproducibili se somministrato ogni 5 minuti.
- Utilizzare i seguenti parametri di registrazione.
- Scala il guadagno del segnale di uscita in modo che corrisponda all'intervallo di tensione di ingresso del convertitore analogico/digitale. Assicurarsi che l'escursione massima prevista del segnale utilizzi almeno il 30% dell'intervallo di tensione di ingresso. Fai attenzione quando imposti guadagni troppo alti, poiché i segnali potrebbero interrompersi. La larghezza di banda tipica necessaria per le registrazioni sul campo è di 500 Hz con accoppiamento CA a 0,1 Hz per rimuovere la deriva della linea di base.
- Digitalizza almeno 4 - 5 volte più velocemente della frequenza d'angolo del filtro passa-basso per evitare l'aliasing del segnale.
