Registrazione dell'elettroretinogramma ad accoppiamento diretto dell'epitelio pigmentato retinico in un topo

Abstract

Fonte: Miyagishima, K. J., et al. Elettroretinogramma ad accoppiamento diretto (DC-ERG) per registrare le risposte elettriche evocate dalla luce dell'epitelio pigmentato retinico del topo. J. Vis. Exp. (2020).

Questo video mostra la registrazione di un elettroretinogramma ad accoppiamento diretto (DC-ERG) su un epitelio pigmentato retinico (RPE) di topo anestetizzato adattato al buio. Dopo aver applicato le gocce dilatanti, l'animale viene posto in una configurazione di registrazione e l'elettrodo capillare riempito con un tampone salino viene posizionato sulla cornea. Dopo aver stabilito la linea di base, viene registrato il DC-ERG.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Posizionamento del mouse e dell'elettrodo

1. Conserva i topi per la notte in una scatola ben ventilata e a tenuta di luce per l'adattamento al buio.
2. Gli animali sono stati anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale di ketamina (80 mg/kg) e xilazina (8 mg/kg).
3. Applicare una goccia di proparacaina HCl allo 0,5% per via topica per anestetizzare la cornea, nonché una goccia di fenilefrina HCl al 2,5% e tropicamide allo 0,5% per dilatare le pupille.
4. Taglia i baffi del mouse con le forbici per evitare che contrazioni involontarie disturbino gli elettrodi capillari di vetro durante la registrazione.
   nota: Il protocollo di stimolo per elettroretinogramma ad accoppiamento diretto (DC-ERG) all'interno del sistema ERG dispone di diverse routine di stimolo integrate che possono essere selezionate facendo clic su Step (freccia avanti) o Step (freccia indietro). Per preparare ed eseguire la registrazione DC-ERG sono necessari solo i passaggi 1, 4 e 5 del software.
5. Nel sistema ERG, il software verifica che sia stato selezionato il paziente corretto. Fare clic sul pulsante verde Protocolli. In Descrizione protocollo selezionare DC-ERG. Quindi fare clic su Esegui. Verificare che questo sia il test corretto eseguito facendo clic su Sì.
6. Utilizzare lo stimolo a luce rossa designato per i passaggi 1/6 per accendere la luce rossa all'interno della cupola per aiutare a posizionare il mouse e gli elettrodi mentre si osservano le variazioni di impedenza.
7. Posiziona il mouse su un tavolo di registrazione riscaldato e tende con cura la pelle della zampa posteriore usando una pinza. Tenere saldamente l'elettrodo dell'ago in una mano e inserirlo per via sottocutanea nella gamba posteriore per fissarlo in posizione.
8. Posizionare l'elettrodo di riferimento Argento/Cloruro di Sivercloruro (Ag/AgCl) (Tabella dei Materiali) all'interno della bocca in modo che il pellet sinterizzato poggi lungo la guancia posteriore e sia tenuto in posizione dietro i denti.
   nota: Gli elettrodi a filo d'oro non devono essere utilizzati come elettrodo di riferimento della bocca in quanto hanno caratteristiche di impedenza diverse e aumentano il rumore picco-picco.
9. Prima di posizionare gli elettrodi capillari sull'occhio del topo, tenere il portaelettrodo con i capillari di vetro verticalmente e muovere il portaelettrodo con il dito indice per rimuovere eventuali bolle che potrebbero essere state introdotte. Riempire la punta con la soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) utilizzando un ago da 25 G collegato a una siringa e ispezionare per assicurarsi che non vi siano bolle d'aria intrappolate sulla punta. Posizionare il supporto portaelettrodo in modo che la punta aperta dei capillari riempiti di HBSS sia a contatto delicato con la cornea.
10. Utilizzare precauzioni particolari per evitare l'introduzione di bolle d'aria tenendo capovolto l'erogatore del gel oculare lubrificante e scartando le gocce iniziali. Metti una goccia di gel lubrificante per gli occhi su ciascun occhio per mantenere la conduttività e prevenire l'essiccazione durante la registrazione.

2. Registrazione DC-ERG

1. Fare clic su Passaggio (freccia avanti) per selezionare Passaggio 4/6 "Long Flash No-Li".
2. Fare clic su Impedenza. Utilizzare la schermata di controllo dell'impedenza per esaminare le resistenze degli occhi sinistro e destro. I valori di impedenza per gli elettrodi di registrazione su ciascun occhio dovrebbero essere simili (~39 kΩ). I valori di impedenza per la terra e gli elettrodi di riferimento dovrebbero essere inferiori a 10 kΩ).
3. Clicca su Anteprima per visualizzare le tracce per l'occhio sinistro e destro. Attendere il raggiungimento di una linea di base stabile (<10 min). Fare clic su Stop per uscire dalla traccia preview.
   nota: Cambiamenti bruschi nella direzione della deriva o rumore aberrante nella registrazione non miglioreranno con il tempo e richiederanno l'identificazione dell'elettrodo capillare che richiede attenzione. La causa più probabile è una bolla introdotta sulla punta dell'elettrodo. Riempire la punta con HBSS. Fare nuovamente clic su Anteprima per controllare la linea di base.
4. Fare clic su Passaggio (freccia avanti) per selezionare il passaggio 5/6 "Long Flash 10 cd 7 min." Fare clic su Esegui per avviare la registrazione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ag/AgCl (bocca) Elettrodo	WPI Inc	EP1	Elettrodo di riferimento per bocca per topo
Piastrelle di ceramica	Strumento Sutter	Cts	Utilizzato per tagliare il tubo capillare in vetro a una dimensione appropriata
la pulizia con punta in cotone	Prodotti medici puritani	867-WC senza colla	Da utilizzare come distanziatore per migliorare l'adattamento del gruppo portaelettrodo
Sistema di elettroretinogramma (ERG)	Diagnosi LLC	Sistema E3	Sistema di elettrofisiologia visiva per diagnosticare le condizioni oftalmiche nella ricerca sulla vista e nelle sperimentazioni farmacologiche
Bruciatore Bunsen	Tecnologie Argos	BW20002460	O equivalente per modellare il vetro sotto fiamma
Tubo capillare in vetro (1,5 mm)	Strumenti Sutter	BF150-75	Per il riempimento con HBSS e il contatto con la cornea
Soluzione salina tamponata di Hank (HBSS)	Thermo Fisher Scientific Inc	Codice 14175-095	Disponibile in commercio. Manutenzione presso RT
Filtro in linea	Whatman	6722-5001	Per proteggere la pompa del vuoto dagli aerosol
Cavo a bassa rumorosità per portamicroelettrodi	WPI Inc	Codice: 5372	Consigliato per migliorare la lunghezza e il posizionamento dei cavi e dei gruppi portaelettrodo
Giunto sferico magnetico	WPI Inc	500871	Per il posizionamento magnetico del gruppo portaelettrodo sul tavolino
MatLab	Mathworks		MatLab: per l'elaborazione del software di analisi
Toolbox Matlab Curvefit	Mathworks		Toolbox per MatLab (necessario solo per l'elaborazione del software di analisi)
Compilatore MatLab	Mathworks		Toolbox per MatLab (necessario solo per l'editing e il rilascio del software di analisi)
MatLab Runtime versione 9.5	Mathworks	R2018b (9,5)	Necessario per eseguire il software di analisi: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html
Supporti per microelettrodi (45 gradi)	WPI Inc	MEH345-15	Per trattenere i capillari
Ago (25 ga)	Covidien	8881250313	Per il riempimento dei tubi capillari con HBSS
elettrodo ad ago (di massa)	Collegamento ritmico	13mm - un elettrodo	Elettrodo ad ago sottocutaneo (rettificato) per topo (lunghezza 13 mm, ago diametro 0,4 mm, filo conduttore 1,5 m)
Regolatore/Condizionatore di potenza	Furman	P-1800	O equivalente per rimuovere l'offset CC dal rumore introdotto attraverso la linea elettrica
Siringa (12 mL)	Monoject	1181200777	Per il riempimento dei tubi capillari con HBSS
Clip a T	Cole-Parmer	Codice 06852-20	Per il montaggio del portaelettrodo
Essiccatore sottovuoto	Bel-Art	Numero 420120000	Fondo e coperchio in policarbonato trasparente
Trattamento farmacologico
Gel oculare lubrificante	Alcon	Codice 0078-0429-47	Aiuta a lubrificare la superficie corneale e a mantenere il contatto elettrico con gli elettrodi capillari
Fenilefrina cloridrato 2,5%	Akorn	Codice 17478-201-15	Collirio midriatico a breve durata d'azione (per la dilatazione della pupilla)
Proparacaina cloridrato 0,5%	Akorn	Codice 17478-263-12	Anestetico locale per instillazione oftalmica
Tropicamide 0,5%	Akorn	Codice 17478-101-12	Collirio midriatico a breve durata d'azione (per la dilatazione della pupilla)
Xilazina	AnaSed	SC-362949RX	Analgesico e miorilassante
Zetamina (ketamina HCl)	VetOne	501072	Anestetico per iniezioni intramuscolari

Bastone per