Registrazioni elettrofisiologiche da Drosophila sensilla in risposta a odori volatili

Abstract

Fonte: Ng, R., et al. Registrazione elettrofisiologica dai sensilli tricoidi di Drosophila in risposta a odoranti di bassa volatilità. J. Vis. Exp. (2017).

In questo video, una mosca di Drosophila viva è montata in un tubo per studi elettrofisiologici. Gli elettrodi sono posizionati alla base del sensillum per registrare specifiche risposte neuronali ai feromoni con i neuroni del recettore olfattivo della mosca.

Protocollo

1. Preparazione dell'hardware per la registrazione at4

1. Utilizzare uno strumento estrattore per pipette per preparare gli elettrodi con capillari in vetro alluminosilicato (diametro esterno 1,0 mm, diametro interno 0,64 mm). Smussare leggermente la punta dell'elettrodo di riferimento con un paio di pinze sottili per facilitare l'inserimento nel clipeo della mosca (cioè una placca arrotondata nella parte anteriore della testa della mosca, sopra l'apparato boccale).
   NOTA: In questo studio sono stati utilizzati maschi WT (Wild type) di 7 giorni (Berlino). Utilizzare una soluzione salina AHL come elettrolita per entrambi gli elettrodi.
2. Preparare 1 L di AHL (Adult Hemolymph-Like) mescolando 900 ml di acqua distillata con 6,312 g di NaCl, 0,373 g di KCl, 0,337 g di NaHCO₃, 0,1120 g di NaH₂PO₄, 1,892 g di trealosio ּ2H₂O, 3,423 g di saccarosio, 1,192 g di HEPES (acido N-2-idrossietilpiperazina-N'-2-etansolfonico), e 8,2 mL di 1M MgCl₂. Utilizzando acqua distillata, portare il volume totale fino a 1 L. Portare il pH a 7,4 utilizzando 1 N NaOH e sterilizzare la soluzione con un sistema di filtraggio a vuoto. Per la conservazione a lungo termine, mantenere le aliquote AHL a 4 °C.
   NOTA: Le consegne costanti di acido palmitoleico dipendono dall'uniformità tra le cartucce. Ogni cartuccia deve essere assemblata in modo riproducibile.
3. Utilizzando una lama di rasoio, rimuovere 0,9 cm dalla punta di una punta per pipetta da 200 μl per creare la prima sezione della cartuccia, che misura 4,1 cm; fare riferimento alle dimensioni dettagliate nella Figura 1A. Utilizzare un altro puntale per pipetta da 200 μl e rimuovere 1,7 cm e 1,5 cm dalla punta e dalla base per creare la seconda sezione della cartuccia, misura 1,8 cm (Figura 1A). Utilizzare un righello per garantire la riproducibilità.
4. Utilizzare una perforatrice da 1/8" per tagliare i dischi dalla carta da filtro.
5. Usa una pinza per posizionare un disco di carta da filtro sulla punta della seconda sezione della cartuccia. Verificare visivamente l'apertura nella punta della cartuccia attraverso la quale può passare l'aria.
6. Fissare la prima e la seconda sezione della cartuccia, come mostrato nella Figura 1A. Inclinare la seconda sezione della cartuccia verso il basso per facilitare il puntamento quadrato alla preparazione (Figura 1B).
7. Collegare la cartuccia con il tubo di erogazione degli odori montato su un micromanipolatore.
   NOTA: Questo design consente di ruotare la cartuccia verso l'esterno per facilitare la sostituzione (Figura 1C).
8. Impostare il flusso d'aria umidificato costante a 2 L/min in un regolatore di massa e il flusso di odorizzante a 500 mL/min in un altro regolatore di massa.
9. Utilizzando il software (vedere la Tabella dei materiali), programmare la procedura per somministrare un soffio di odore da 500 ms.

2. Preparazione di soluzioni odorizzanti di acido palmitoleico per la consegna

NOTA: Gli ORN Or47b rispondono sia all'acido cis- che al trans-palmitoleico. Poiché l'acido palmitoleico è instabile a RT, le scorte vengono conservate a -20 °C e utilizzate entro un mese dall'apertura. L'etanolo è il solvente di scelta per l'acido palmitoleico.

1. Utilizzare un miscelatore a vortice per miscelare accuratamente 10 μL di stock o diluizioni di acido cis o trans-palmitoleico con 90 μL di etanolo al 100% per diluizioni seriali dieci volte superiori in microprovette da 1,7 mL. Preparare diluizioni fresche di acido palmitoleico ogni giorno prima degli esperimenti e utilizzarle entro un giorno.
   NOTA: Si consiglia una fiala di vetro per gli odorizzanti non solubili in etanolo per preparare diluizioni di odori con altri tipi di solventi organici.
2. Utilizzando una micropipetta P10, applicare 5 μL di soluzioni di acido cis-palmitoleico delle diluizioni desiderate sulla carta da filtro in ciascuna cartuccia corrispondente.
   NOTA: Il dosaggio più alto (^10-1) contiene 450 μg del composto. Per le soluzioni di acido trans-palmitoleico, applicare invece 4,5 μL in modo che il dosaggio più alto (^10-1 ) contenga 450 μg del composto.
3. Porre le cartucce di acido palmitoleico in un essiccatore sottovuoto per 1 ora a RT e 7,59 mmHg di pressione per far evaporare completamente il solvente.
   NOTA: Le cartucce possono essere utilizzate per un massimo di 4 ore in RT.

3. Preparazione di Drosophila per un Accesso Immediato al Sensilla at4 per Registrazioni Elettrofisiologiche In Vivo

NOTA: Le mosche WT (Berlino) vengono allevate in un terreno standard di farina di mais a 25°C in un ciclo luce-buio 12:12. Dopo l'eclosione, i moscerini vengono separati in base al sesso in gruppi di dieci, per cui vengono alloggiati in gruppo fino ai 7 giorni di età. Gli ORN (neuroni del recettore olfattivo) Or47b nei moscerini maschi e femmine rispondono all'acido palmitoleico. Per semplicità, solo le mosche maschi sono esaminate nello studio attuale.

1. Assemblare un vetrino per la preparazione delle mosche: su un vetrino, posizionare un vetrino coprioggetti di vetro (18 x 18 mm2) su una piccola quantità di argilla da modellare, formando un angolo di ~3° con il vetrino. Posizionare il nastro biadesivo sul bordo interno del vetrino coprioggetti e sull'area del vetrino immediatamente sottostante. Sostituire con nastro adesivo nuovo per ogni giorno di registrazione (Figura 2A).
2. Utilizzare un aspiratore a mosca15 per raccogliere la mosca di interesse nel tubo, quindi inserire un puntale per pipetta da 200 μl sull'estremità del tubo. Contemporaneamente, muovere il tubo in avanti mentre si soffia aria al suo interno per spingere la mosca fino all'estremità del puntale della pipetta. Usa una lama di rasoio per tagliare appena sotto il corpo della mosca e 2 lunghezze di teste sopra la mosca.
3. Tamponare la parte inferiore della punta della pipetta con argilla da modellare, spingendo la mosca verso l'alto fino a quando sia le antenne che il clipeo sono esposti (Figura 2B). Per evitare di uccidere la mosca, aggiungi solo abbastanza argilla per esporre le antenne e l'aristae, in quanto ciò impedisce che l'addome della mosca venga schiacciato. Inoltre, aggiungere l'argilla lentamente e delicatamente per evitare costrizioni improvvise. Conferma che la mosca è viva controllando il movimento dell'antenna o della proboscide.
4. Usa una pinza per manovrare la punta della pipetta che ospita la mosca. Orientare la testa in modo che il clipeo sia rivolto verso la destra dell'osservatore. Regolare la preparazione lungo il vetrino coprioggetti utilizzando una pinza fine fino a quando il lato laterale dell'antenna non si trova contro la superficie del vetrino coprioggetti nastrato (Figura 2B).
5. Posizionare un'asta di supporto sull'arista per fissare l'antenna al nastro biadesivo per impedirne il movimento (Figura 2B).
   NOTA: L'asta di supporto viene estratta da un capillare in vetro borosilicato con un estrattore per pipette e tenuta in posizione con argilla da modellare (Figura 2A).
6. Posizionare la preparazione sul tavolino del rig (Figura 2C). Utilizzando il microscopio, verificare che il tricoide sia visibile lungo il bordo distale-laterale del terzo segmento dell'antenna.
   NOTA: I sensilli devono essere stagliati sullo sfondo, semplificandone l'identificazione e facilitando la registrazione (Figura 3). In questa preparazione, i sensilli tricoidi più accessibili sono del tipo at4.
7. Come descritto in precedenza, 2, 15, mantenere la preparazione sotto un flusso d'aria umidificato costante (2 L/min) erogato tramite un tubo di mandata dell'aria separato a circa 2 cm dalla preparazione (Figura 4).

4. Registrazione dell'attività del sensillum at4 dagli ORN Or47b nei tricoidi at4 in risposta all'acido palmitoleico

1. Inserire l'elettrodo di riferimento nel clipeo (Figura 3A). Con un movimento rapido e fluido, assicurarsi che l'elettrodo sia inserito appena sotto la superficie, dove può entrare in contatto con l'emolinfa sotto la cuticola per evitare danni ai tessuti.
2. Abbassare lentamente l'elettrodo di registrazione fino a quando non entra nello stesso piano di visualizzazione del sensillum target (Figura 3B). Registra con un obiettivo 50X.
   nota: La robusta cuticola tricoidale richiede l'inserimento dell'elettrodo di registrazione nella base sensillare, la cui area più ampia fornisce un bersaglio più ampio che riduce la probabilità che l'elettrodo venga deviato (Figura 3B, riquadro).
3. Prima di applicare gli stimoli odorosi a un sensillum, osservare i seguenti criteri di selezione: qualsiasi tricoide che non soddisfi questi standard dovrebbe essere rifiutato e al suo posto dovrebbe essere scelto un altro sensillum.
   1. Osservare un elevato rapporto segnale/rumore (vedere la Figura 3C per un esempio).
   2. Osservare i picchi identificabili dai neuroni at4A e at4C (Figura 3C).
      NOTA: L'ampiezza del picco at4B appare molto simile a quella di at4A10 e non può essere identificata facilmente senza stimolazione degli odori.
   3. Osservare che la velocità di attivazione basale dei neuroni at4A è intorno o inferiore a 20 Hz.
      NOTA: Questo criterio è specifico per at4A perché la velocità di attivazione basale per il neurone è superiore a quella degli ORN basali. Un'attivazione basale molto più alta indica che i neuroni potrebbero essere stati danneggiati durante l'inserimento dell'elettrodo.
4. Collegare la cartuccia al tubo di erogazione dell'odorizzante. A partire dal controllo dei solventi e poi dagli odorizzanti, da basse ad alte concentrazioni. Utilizzare il micromanipolatore per manovrare la cartuccia verso la preparazione mentre si punta la cartuccia esattamente verso la testa della preparazione. Verificare visivamente che la cartuccia sia puntata direttamente verso l'antenna (Figura 4) da alcuni millimetri di distanza.
   NOTA: L'obiettivo è orientare l'apertura della cartuccia direttamente sull'antenna e posizionarla vicino al tessuto bersaglio.
5. Assicurarsi che la cartuccia dell'odorizzante sia separata dall'elettrodo di registrazione alla sua destra di 1 - 2 mm e dal vetrino di preparazione delle mosche sottostante di circa 1 mm.
   nota: Nella configurazione qui descritta, la cartuccia dell'odorizzante è strettamente delimitata dall'elettrodo di registrazione, dall'elettrodo di riferimento e dal vetrino di preparazione al volo (Figura 4).
   NOTA: Considerare la distanza tra la cartuccia e gli elettrodi di registrazione/riferimento. Si consiglia una distanza di circa 4 mm. Il contatto non intenzionale può terminare il segnale e rompere la punta dell'elettrodo di registrazione, danneggiando il neurone corrente e complicando ulteriori registrazioni.
   NOTA: Considerare la distanza che separa la cartuccia e il vetrino di preparazione al volo. Toccare il vetrino coprioggetti può anche spostare l'elettrodo di registrazione, interrompendo la registrazione.
6. Premere "Registra" nel software di acquisizione dati per iniziare la registrazione.
   NOTA: Per ogni registrazione di 10 secondi, un singolo impulso di odore di 500 ms viene inviato direttamente all'antenna, come descritto al punto 1.9.
7. Dopo aver applicato l'odorizzante, ritrarre con cura la cartuccia prima di sostituirla con una cartuccia della concentrazione successiva più alta. Continuare fino ad ottenere l'intero intervallo di dosaggio.
   NOTA: Si consiglia di registrare un solo ORN Or47b per ogni mosca per evitare possibili effetti di adattamento.
8. Sciacquare accuratamente l'elettrodo di registrazione con acqua distillata dopo aver terminato la registrazione della giornata.
9. Analizza e traccia i dati utilizzando il software di analisi offline disponibile in commercio.

Risultati

Figura 1: Configurazione della cartuccia e dell'olfattometro. (A) Preparazione delle cartucce per gli odori. Da sinistra a destra: un puntale per pipetta standard da 200 μL, la prima e la seconda sezione della cartuccia e una cartuccia di odorizzante completa. (B) La cartuccia collegata all'olfattometro, che mostra l'angolazione verso il basso della seconda sezione. (C) Configurazione dell'olfattometro raffigurante i...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Preparazione Impostazione e materiali vari
Strumento estrattore per pipette	Sutter Instruments ,Novato CA USA	P97	Estrattore per pipette
Capillari in vetro borosilicato	Strumenti di precisione mondiali, Sarasota FL USA	1B100F-4	per realizzare aste di tenuta
Capillari in vetro alluminosilicato	Sutter Instruments, Novato, CA, Stati Uniti	AF100-64-10	per fare elettrodi
Vetrini per microscopio Superfrost	Fisher Scientific, Pittsburgh PA USA	12-550-143	per stazione di preparazione delle mosche
Nastro biadesivo permanente	Scozzese St. Paul MN Stati Uniti	Na	per stazione di preparazione delle mosche
Microscopio dritto	Olimpo, Shinjuku Tokyo Giappone	BX51	per impianto di registrazione
Argilla da modellare Plastalina	Van Aken, North Charleston SC Stati Uniti	B0019QZMQQ	per la stazione di preparazione e per stabilizzare l'asta di supporto
Unità filtrante monouso sterile a flusso rapido con membrana SFCA, 0,45 mm	Nalgene, Rochester NY Stati Uniti	#156-4045	per sterilizzare la soluzione AHL
Puntale per pipetta da 200 μl	VWR Radnor, PA Stati Uniti	Codice: 53508-810	per realizzare cartucce per odori e preparazione alle mosche
Carta da filtro	Whatman, Maidstone Kent Regno Unito	740-E	per realizzare cartucce per odori
Essiccatore sottovuoto	Cole-Parmer, Vernon Hills IL USA	VX-06514-30	per vaporizzare solvente di etanolo
acido cis-palmitoleico	Cayman Chemical, Ann Arbor MI Stati Uniti	#10009871 (CAS # 373-49-9)	Or47b odorante
acido trans-palmitoleico	Cayman Chemical, Ann Arbor MI Stati Uniti	#9001798 (CAS # 10030-73-6)	Or47b odorante
etanolo	Spettro, Chimico, MFG., New Brunswick, NJ, Stati Uniti	E1028-500MLGL	per diluire l'acido palmitoleico
Micromanipolatore a cartuccia odorizzante	Siskiyou, Grants Pass O Stati Uniti d'America	MX130R	per posizionare l'olfattometro
Software di visione del flusso	Alicat, Tuscon AZ Stati Uniti	FLOWVISIONSC	Software per il controllo della portata
Controllore di massa	Alicat, Tuscon AZ Stati Uniti	MC-2SLPM-D	per controllare la portata dell'aria umidificata
Controllore di massa	Alicat, Tuscon AZ Stati Uniti	MC-500SCCM-D	per controllare la portata per la stimolazione degli odori
Morsetto	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Ver. 10.4	Software di acquisizione dati
Tubo di mandata dell'aria	Ace Glass, Vineland NJ Stati Uniti	8802-936	per fornire aria umidificata
Obiettivo 50X	Olimpo, Shinjuku Tokyo Giappone	LMPLFL50X	impianto di registrazione
Morsetto 10	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Ver. 10.4	Software per l'analisi dei picchi
Igor Pro 6	WaveMetrics, Lago Oswego OR USA	Ver. 6.37	Software per l'analisi dei dati
Monitor audio	ALA Scientific Instruments, Farmingdale NY USA	NPIEXB-AUDIS-08B	Segnala acusticamente i singoli picchi
Amplificatore extracellulare	ALA Scientific Instruments, Farmingdale NY USA	NPIEXT-02F	per aumentare l'ampiezza dei segnali elettrici
Regolatore della valvola	Strumenti Warner	VC-8	per controllare l'apertura della valvola per la stimolazione degli odori
Micromanipolatore con elettrodi di registrazione	Sutter Instruments, Novato, CA, Stati Uniti	MP-285	per posizionare l'elettrodo di registrazione
Amplificatore per headstage	ALA Scientific Instruments, Farmingdale NY USA	EQ-16.0008	per aumentare l'ampiezza dei segnali elettrici
oscilloscopio	Tektronix, Beaverton OR Stati Uniti	TDS2000C	Rapporto visivo dei singoli picchi