Stimolazione della radice del nervo uditivo e registrazioni di corrente postsinaptica in una fetta di cuneo cerebrale di topo

Abstract

Fonte: Fischl, M. J., et al. Preparazione di fette di cuneo in vitro per imitare la connettività del circuito neuronale in vivo. J. Vis.(2020)

Questo video dimostra un protocollo per stimolare la radice del nervo uditivo e registrare correnti postsinaptiche nei neuroni olivocochlorici mediali in fette di cuneo cerebrale di topo.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Impostazione e registrazione dell'elettrofisiologia

1. Posizionare la fetta a cuneo nella camera di registrazione e fissarla con un'arpa o un sistema di stabilizzazione. Perfondere continuamente il tessuto a una velocità di 7-10 mL/min con ACSF caldo (35 °C) bollito con carbogeno.
2. Identificare i neuroni MOC olivocochlear mediali geneticamente marcati nel nucleo ventrale del corpo trapezoidale VNTB utilizzando l'epifluorescenza con filtri di emissione a 561 nm per registrazioni patch-clamp. Capovolgi la sezione se non ci sono celle potenzialmente patchabili.
3. Utilizzando l'ottica DIC, concentrarsi sulla radice del nervo uditivo sul lato spesso della fetta e utilizzare un micromanipolatore per spostare l'elettrodo stimolante il tungsteno bipolare verso il basso fino alla radice del nervo uditivo e delicatamente sulla superficie del tessuto><. nota: Gli elettrodi di aspirazione sono stati utilizzati in esperimenti di stimolazione del nervo uditivo in altri laboratori. Gli elettrodi in vetro theta o i metodi di stimolazione ottica possono essere impiegati se applicabili ad altre preparazioni specifiche.
4. Sposta il campo visivo di nuovo sul VNTB per scegliere un neurone MOC da scegliere come bersaglio per l'elettrofisiologia del patch clamp.
5. Riempire una pipetta di registrazione con una soluzione interna appropriata per l'esperimento proposto.
6. Applicare patch e registrare dal neurone MOC nella configurazione a cellula intera. Se necessario, compensare la capacità della membrana e la resistenza in serie.
7. Regolare l'ampiezza della stimolazione elettrica della radice nervosa uditiva per ottenere eventi postsinaptici coerenti nel neurone MOC.
   nota: Potrebbe essere necessario spostare l'elettrodo di stimolazione.
8. Eseguire protocolli di stimolazione appropriati per osservare le correnti sinaptiche evocate in MOC (voltage clamp).
   nota: La preparazione della fetta a cuneo può essere utilizzata con qualsiasi strumento tipico di patch-clamp come registrazioni di patch sciolte, farmacologia, optogenetica, imaging del calcio, uncaging dei neurotrasmettitori, ecc.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Microscopio confocale verticale A1R	Strumenti Nikon		Microscopio per elettrofisiologia e imaging, può essere qualsiasi microscopio compatibile con l'elettrofisiologia
Elettrodo in vetro borosilicato con filamento OD 1,5 mm, diametro interno 1,1 mm, lunghezza 10 cm	Strumento Sutter	BF150-110-10	Pipetta di bloccaggio patch in vetro
Riempitivo per elettrodi MicroFil	WPI	CMF20G	Riempitrice per pipette con elettrodo patch
Riscaldatore per soluzione in linea	Strumenti Warner (GSAdvantage)	SH-27B	Riscaldatore del sistema di perfusione a fette
Sistemi multi-micromanipolatori	Strumenti Sutter	MPC-200 con MP285	Micromanipolatori per patch clamp e posizionamento dell'elettrodo di stimolazione
Estrattore per pipette orizzontale P-1000 per micropipette in vetro	Strumenti Sutter	FG-P1000	Estrattore per pipettatore a pinza
Amplificatore patch-clamp e software	HEKA	EPC-10 / Patchmaster Successivo	Può essere qualsiasi amplificatore/software
Camera di registrazione	Strumenti Warner	RC26G	Affettare il "bagno" durante la registrazione
Arpa da camera di registrazione	Strumenti Warner	640253	Stabilizza la fetta durante la registrazione elettrofisiologica
Camera di incubazione Slice	Costruzione personalizzata		Camera di contenimento riscaldata e ossigenata per fette durante il recupero dopo l'affettatura
Unità di isolamento per stimoli	A.M.P.I.	Iso-Flex	Unità di isolamento dello stimolo per elettrofisiologia
Siringa 60CC	Fischer Scientific (Intramalls)	14-820-11	Elettrofisiologia perfusione fluida movimentazione
Regolatore di temperatura	Strumenti Warner (GSAdvantage)	TC-324C	Regolatore di temperatura per sistema di perfusione a fette
Tubo 1/8 OD 1/16 ID	Fischer Scientific (Intramalls)	14-171-129	Elettrofisiologia perfusione fluida movimentazione
Microelettrodo bipolare concentrico di Tugsten	WPI	TM33CCINS	Elettrodo stimolante per elettrofisiologia

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