Registrazione delle risposte sinaptiche CA3-CA1 in una fetta di ippocampo di ratto

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Registrazione delle risposte sinaptiche CA3-CA1

NOTA: La configurazione elettrofisiologica utilizzata per la registrazione del potenziale di campo è mostrata nella Figura 1A. Una gabbia di Faraday è fortemente consigliata se l'interferenza elettrica è al di fuori del controllo dopo la corretta messa a terra delle impostazioni elettriche. In commercio sono disponibili diversi tipi di camere sommerse e di interfaccia. Tuttavia, le camere di interfaccia sono preferite in quanto le fette mostrano risposte sinaptiche più robuste in esse.

1. Posizionamento degli elettrodi
   1. Accendere l'apparato elettrico (stimolatori e amplificatori) da utilizzare. Montare e fissare gli elettrodi di stimolazione e registrazione nei supporti in plexiglass dei micromanipolatori.
      nota: Utilizziamo elettrodi monopolari, verniciati, in acciaio inossidabile con resistenza di 5 MΩ sia per scopi di stimolazione che di registrazione.
   2. Prima dell'uso, inserire questi elettrodi all'interno dei capillari di vetro tirati e fissarli con colla epossidica, esponendo solo una piccola parte della punta dell'elettrodo (Figura 1E). Questo dà forza agli elettrodi altrimenti sottili e aiuta a fissarli saldamente nei portaelettrodi.
   3. Guidati al microscopio, posizionare l'elettrodo o gli elettrodi stimolanti nello strato radiale della regione CA1 per stimolare le fibre collaterali di Schaffer e l'elettrodo di registrazione nella regione dendritica apicale di CA1 per registrare le risposte di campo EPSP (fEPSP).
      nota: Avvicinandosi alla superficie del liquido sopra la fetta con gli elettrodi si ottiene un suono che aiuta a localizzare rapidamente la superficie della fetta (a condizione che l'amplificatore sia collegato a un altoparlante).
   4. Negli esperimenti di marcatura e cattura sinaptica, a seconda delle necessità dell'esperimento, posizionare due o tre elettrodi stimolanti (S1, S2 o S3) su entrambi i lati dell'elettrodo di registrazione per stimolare due o più input indipendenti ma sovrapposti. Posizionare gli elettrodi di stimolazione e di registrazione a circa 200 μm di distanza.
   5. Se necessario, individuare un altro elettrodo di registrazione nello strato piramidale per registrare il picco di popolazione (Figura 2A). Quando entrambi gli elettrodi hanno toccato la fetta, utilizzando il software di acquisizione, eseguire una stimolazione di prova per garantire un segnale fEPSP corretto.
      nota: Per la stimolazione di prova utilizziamo impulsi bifasici a corrente costante (durata dell'impulso 0,1 msec/semionda).
   6. Una volta ottenuto un segnale fEPSP corretto, abbassare con cautela gli elettrodi a circa 200 μm di profondità utilizzando le manopole di movimento fine dei manipolatori. Attendere 20 minuti affinché le fette si riprendano.
2. Relazione input-output
   1. Determinare la relazione input-output (stimolazione afferente vs pendenza fEPSP) per ciascun input misurando il valore della pendenza a un intervallo di intensità di corrente. Eseguire questa operazione tra 20 μA e 100 μA. Quindi impostare l'intensità di stimolazione per ciascun input per ottenere il 40% della pendenza massima di fEPSP. Mantieni questa costante per tutta la durata dell'esperimento.
   2. Dopo 15-20 minuti, inizia a registrare la linea di base. Monitorare attentamente la pendenza fEPSP durante questo periodo e reimpostare l'intensità dello stimolo se la pendenza fluttua di oltre il 10% rispetto al valore impostato e iniziare una nuova linea di base. Registrare almeno 30 minuti o 1 ora di linea di base stabile prima di procedere.
      nota: Per il test o la stimolazione di base, utilizziamo quattro sweep di impulsi bifasici a corrente costante da 0,2 Hz (0,1 msec per polarità) somministrati ogni 5 minuti. Una pendenza media di queste quattro risposte viene quindi considerata come una ripetizione. I segnali vengono filtrati e amplificati da un amplificatore differenziale, digitalizzati tramite un convertitore analogico-digitale e monitorati online con software su misura.

Figura 1.Impianto di elettrofisiologia per registrazioni di potenziale di campo costituito da (A) stimolatori (b) un amplificatore differenziale (c) un convertitore analogico-digitale (d) Oscilloscopio (e) computer con software di acquisizione (f) Microscopio da tavolo resistente alle vibrazioni (g) con ingrandimento >4x (h) Interfaccia camera a fetta cerebrale (i) un sistema di perfusione per ACSF e alimentazione di carbogeno (j) Regolatore di temperatura (k) Una sorgente di illuminazione (l) Manipolatori con portaelettrodi. (B) Camera di interfaccia del cervello. (C) e (D) Fette di ippocampo nella camera di interfaccia. (E) Elettrodo di acciaio inossidabile sigillato in un capillare di vetro.

Figura 2.(A) Rappresentazione schematica di una fetta ippocampale trasversale e della posizione dell'elettrodo per la registrazione del potenziale di campo: in questa rappresentazione, due elettrodi stimolanti (S1 e S2) sono posizionati nello strato radiato della regione CA1 per stimolare due input sinaptici indipendenti ma sovrapposti sui neuroni piramidali CA1. Due elettrodi di registrazione extracellulari, uno per registrare l'EPSP di campo (potenziale post-sinaptico eccitatorio) dal compartimento dendritico apicale e un altro per registrare il picco di popolazione somatica dai corpi cellulari piramidali, si trovano rispettivamente nello strato radiato e nello strato piramidale. CA1- regione 1 dell'ammonide del cornu, CA3- regione 3 dell'ammonide del cornu, DG- giro dentato, SC- fibre collaterali di Schaffer, elettrodo stimolante 1 S1, elettrodo 2 stimolante S2. (B) Paradigma debole prima forte per studiare STC: la tetanizzazione debole (WTET) viene applicata a S1 (cerchi aperti) per indurre l'LTP precoce seguita da una tetanizzazione forte (STET) di S2 (cerchi pieni) a 30 minuti per indurre l'LTP tardivo. L'LTP precoce in S1 viene rinforzato a LTP tardivo mostrando l'interazione di marcatura e cattura (n = 6). (C) Paradigma debole prima forte per studiare il cross-tagging: L'LTP precoce è indotto dal WTET in S1 (cerchi aperti) seguito dall'induzione di LTD tardivo in S2 (cerchi pieni) utilizzando SLFS dopo 30 minuti. In S1, l'LTP precoce viene trasformato in LTP tardivo della durata di 6 ore, mostrando il cross-tagging e l'acquisizione (n = 6). La freccia singola rappresenta la tetanizzazione debole applicata per indurre l'LTP precoce. La tripletta di frecce rappresenta una forte tetanizzazione per indurre la tardiva LTP. La freccia spezzata rappresenta il punto temporale in cui SLFS è stato applicato all'input sinaptico rappresentativo per indurre la LTD tardiva. Le barre di errore indicano il SEM.