Rilevamento delle risposte fisiologiche dai neuroni sensoriali in Drosophila

1. Preparazione del campione

1. Attraversare la linea del driver Gal4 per UAS-GCaMP5G Drosophila melanogaster vola (w; P{20XUAS-IVS-GCaMP5G}attP40). Lasciare crescere l'incrocio a 25 °C.
   nota: La generazione di mosche con più copie dei transgeni Gal4 o UAS-GCaMP può aiutare a migliorare l'intensità del segnale fluorescente. Una versione precedente del transgene UAS-GCaMP (UAS-GCaMP3) ha mostrato un'intensità di fluorescenza molto debole quando espressa sotto il controllo del driver Gr68a-Gal4.
   1. Raccogliere e separare per sesso le mosche adulte appena chiuse e allevarle a 25 °C.
      NOTA: Il livello basale di fluorescenza GCaMP5G è ottimale nei moscerini di età compresa tra 14 e 28 giorni. Isolare i moscerini in base al sesso preclude la possibilità di interazioni sociali che possono influenzare le risposte neurali.
2. Anestetizzare una mosca sotto un lieve flusso di CO₂.
3. Attacca la mosca a un vetrino coprioggetti posizionando prima una piccola goccia di smalto al centro di un vetrino coprioggetti da 0,17 mm. Posiziona delicatamente una mosca su un lato sulla goccia di smalto trasparente e assicurati che la mosca copra l'intera goccia.
4. Eseguire i passaggi 1.5 e 1.6 con uno stereomicroscopio da dissezione, utilizzato con ingrandimento 8X.
5. Usa un pennello bagnato per estendere la zampa anteriore della mosca. Fissare la zampa anteriore in posizione posizionando due sottili strisce di nastro adesivo sul primo e sul quinto segmento tarsale (Figura 1A). Ciò esporrà i segmenti tarsali T2-T4 per l'imaging (Figura 1B).
6. Per visualizzare i neuroni sulla proboscide, posizionare una sottile striscia di nastro adesivo sul rostro della proboscide per esporre il labello (Figura 1C, D).
7. Disegna una barriera idrofobica intorno alla mosca con una penna PAP (Perossidasi-antiperossidasi) per evitare che la soluzione scorra sulla superficie del vetrino. Misurare entro 30 minuti dal montaggio.

2. Preparazione della Soluzione di Stimolo

1. Ligandi lipofili diluiti (come CH₅0₃, utilizzati in questo studio) in una soluzione PBST (soluzione salina tamponata con fosfato con Triton X-100): 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, 0,1% Triton X-100 (v/v); pH 7,4.
   1. Preparare una soluzione madre da 1 mg/ml del legante utilizzando PBST. Preparare tutte le diluizioni successive della soluzione madre utilizzando PBST.
      nota: A seconda della solubilità del legante di interesse, possono essere necessari diversi solventi per dissolverlo. La tabella 1 descrive la solubilità di CH₅0₃ in vari solventi. A differenza di altri solventi, il PBST non ha aumentato la fluorescenza.

3. Stimolazione dei neuroni gustativi e acquisizione di immagini

1. Utilizzando un pipettatore da 10 μl, posizionare 10 μl di PBST sui segmenti tarsali.
   nota: Questo passaggio inumidisce la gamba e impedisce ai segmenti tarsali di andare alla deriva.
2. Utilizzare un sistema ottico dotato di una fotocamera di velocità e sensibilità sufficienti per ottenere un buon segnale di fluorescenza ad alta risoluzione temporale.
   nota: Per questo studio, abbiamo utilizzato un microscopio confocale a disco rotante e una fotocamera sCMOS (vedi Elenco dei materiali).
3. Scegli il segmento tarsale e i neuroni specifici da visualizzare. Acquisisci tre Z-stack confocali pre-stimolazione.
   1. Idealmente, utilizzare impostazioni di acquisizione sufficientemente veloci da consentire la massima risoluzione temporale pur catturando l'intero volume cellulare. Le impostazioni di acquisizione di esempio sono: esposizione a 200 msec, binning di sezioni ottiche 2 x 2 e 6 x 0,5 μm2, acquisite ogni 2 sec.
      NOTA: Le gambe immobilizzate sono state riprodotte con successo per un massimo di 10 minuti, a intervalli di 30 secondi, senza sbiancamento percepibile del segnale GCaMP. Per tempi di registrazione più lunghi, assicurarsi che le gambe siano tenute molto saldamente in posizione sul vetrino coprioggetti.
   2. Ottimizza la potenza del laser per ottenere il massimo rapporto segnale/rumore ottenibile con un photobleaching minimo durante l'intero regime di imaging. Per gli esperimenti qui descritti, utilizzare un laser a diodi da 491 nm (100 mW) al 30% di trasmissione per visualizzare sia i neuroni gustativi Gr68a che ppk23 sulle gambe e sulla proboscide. Utilizzare il binning 2 x 2 per consentire tempi di esposizione più brevi, pur ottenendo una risoluzione spaziale sufficiente.
      nota: Le impostazioni di potenza del laser sono state ottimizzate per rilevare le variazioni fluorescenti che vanno da un aumento di 1,2 a 4,5 volte.
4. Pipettare 10 μl della soluzione di stimolo sui segmenti tarsali. Aggiungere altri 10 μl di PBST per gli esperimenti di controllo. Acquisire immediatamente 117 immagini post-stimolazione.
   nota: Il numero di immagini post-stimolazione acquisite si basa sul tempo impiegato per raggiungere la variazione massima della fluorescenza (circa 2 minuti).
   1. PASSAGGIO CRITICO: Quando si pipetta la soluzione sulla preparazione, non toccare la mosca con la punta della pipetta, poiché ciò causerebbe lo spostamento della zampa anteriore fuori posizione.
      nota: In alternativa, utilizzare un micromanipolatore per posizionare con precisione un capillare di vetro contenente lo stimolo vicino al segmento tarsale da visualizzare. Erogare volumi controllati di stimolo utilizzando un dispenser di microiniezione intracellulare secondo le istruzioni del produttore.

Figura 1: Montaggio di una mosca viva per l'imaging dei neuroni della zampa anteriore o della proboscide. (A) Montaggio della zampa anteriore: un'immagine 3.2X di una mosca maschio viva, che mostra le zampe anteriori fissate al vetrino coprioggetti con nastro adesivo. (B) Un'immagine 40X della mosca mostra ciascuno dei segmenti tarsali (T1-5) e il posizionamento del nastro sopra il primo segmento tarsale e sul quinto segmento tarsale. (C) Montaggio della proboscide: un pezzo di nastro adesivo viene posizionato sopra il rostro per esporre la punta della proboscide. (D) La punta della pipetta per l'aggiunta dello stimolo è tenuta leggermente sopra la mosca e non entra in contatto diretto con la preparazione.

Tabella 1: Solubilità di CH503 in vari solventi. DMSO: Dimetilsolfossido. Le soluzioni di etanolo, esano e DMSO sono state diluite con dH2O (v/v). La solubilità di CH503 in DMSO allo 0,2% era limitata a soli 250 ng/ml. L'aumento di ΔF/F con il solo solvente è stato equivalente a quello osservato dopo la stimolazione con feromone.