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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Chirurgia
NOTA: I dettagli esatti dell'intervento chirurgico per la stimolazione a circuito chiuso dipendono dal tipo di sonde di registrazione utilizzate e dalle aree cerebrali mirate. Nella maggior parte dei casi, tuttavia, un tipico intervento chirurgico consisterà nei seguenti passaggi.
- Porta una gabbia con un ratto in sala operatoria per essere impiantato con una sonda in silicone o un array di elettrodi per registrare l'attività neuronale.
- Anestetizzare il roditore con isoflurano al 2-2,5% e fissare la testa in un telaio stereotassico. Assicurarsi che l'animale sia incosciente durante l'intervento chirurgico osservando qualsiasi reazione motoria a lievi stimoli tattili.
- Applicare un unguento per gli occhi per ridurre al minimo la secchezza durante l'intervento chirurgico.
- Radere l'area chirurgica e disinfettare la pelle con una soluzione di clorexidina al 2% e alcol isopropilico al 70%.
- Iniettare lidocaina (5 mg/kg) sotto il cuoio capelluto sopra l'area del cervello dove verranno impiantati gli elettrodi.
- Praticare un'incisione del cuoio capelluto sull'area del futuro impianto e utilizzare un bisturi e un batuffolo di cotone per liberare il periostio dal cranio esposto.
- Praticare 4-8 fori nel cranio per l'impianto di viti di ancoraggio (~0,5 mm) come supporto strutturale per l'impianto. Fissare le viti al teschio inserendole nei fori e assicurarsi che siano tenute saldamente in posizione.
- Praticare la craniotomia alle coordinate specificate e inserire l'impianto di microdrive/sonda.
nota: Il protocollo descritto per la stimolazione a circuito chiuso funzionerà per qualsiasi regione del cervello in cui sono inseriti gli elettrodi.
- Fissare il microdrive/sonda e qualsiasi connettore di interfaccia elettrica richiesto al cranio utilizzando l'acrilico dentale. La quantità di acrilico dentale dovrebbe essere sufficiente per fissare saldamente l'impianto, ma non dovrebbe entrare in contatto con i tessuti molli circostanti.
- Dopo l'intervento chirurgico, monitorare attentamente l'animale fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale. Per i tre giorni successivi, somministrare per via sottocutanea un analgesico (ad es. Metacam, 1 mg/kg) e un antibiotico per prevenire l'infezione (ad es. enrofloxacina, 10 mg/kg).
nota: Gli animali vengono in genere lasciati a riprendersi dall'intervento chirurgico per una settimana prima di qualsiasi test o registrazione.
2. Installazione del software
NOTA: Questo è stato testato su Windows 10, versione a 64 bit.
- Installare il software di acquisizione ed elaborazione dati.
- Installa il sistema di acquisizione dati Cheetah 6.4 (https://neuralynx.com/software/category/sw-acquisition-control), che include librerie per interagire con il sistema di acquisizione Cheetah.
- Installa SpikeSort3D (https://neuralynx.com/software/spikesort-3d) o qualsiasi altro software che utilizzi KlustaKwik27 per l'ordinamento delle punte. Il software di rilevamento online utilizza le definizioni dei cluster del motore KlustaKwik. Questo software può essere eseguito sullo stesso computer o su computer separati sulla stessa rete.
- Installare NetComDevelopmentPackage (https://github.com/leomol/cheetah-interface/blob/master/NetComDevelopmentPackage_v3.1.0), che può essere scaricato anche da https://neuralynx.com/software/netcom-development-package.
- Installa Matlab (https://www.mathworks.com/downloads/; il codice è stato testato su Matlab versione R2018a). Assicurati che Matlab sia abilitato nel firewall di Windows. Normalmente, durante la prima connessione viene visualizzato un pop-up.
- Accedi a un account Matlab. Scegli la licenza. Scegli la versione. Scegli il sistema operativo.
- Scarica la seguente libreria per l'attivazione di eventi online da https://github.com/leomol/cheetah-interface ed estrai i file nella cartella "Documenti/Matlab" del computer. Una copia del codice è fornita nei materiali supplementari allegati.
3. Acquisizione iniziale dei dati
- Avvia l'acquisizione dei dati utilizzando il software Cheetah.
- Registra alcuni minuti di dati di picco per popolare le forme d'onda del modello.
- Arrestare l'acquisizione dei dati ed eseguire l'ordinamento dei picchi sui dati registrati.
- Apri SpikeSort3D, fai clic su File | Menù | Carica il file spike e seleziona un file spike dalla cartella con i dati registrati.
- Fare clic su Menu cluster, quindi su Autocluster using KlustaKwik, lasciando le impostazioni predefinite, quindi su Esegui.
4. Esperimento a circuito chiuso
- Riprendi l'acquisizione dei dati in Cheetah.
- Apri Matlab.
- Apri ClosedLoop.m e fai clic su Esegui. In alternativa, nella finestra di comando di Matlab, eseguire ClosedLoop(). Assicurarsi che ClosedLoop.m si trovi sul percorso Matlab. Se l'utente desidera utilizzare una funzione personalizzata per chiamare ogni trigger, eseguire invece ClosedLoop('-callback', customFunction), dove customFunction è un handle per tale funzione.
- Caricare le informazioni sui picchi definite nella registrazione iniziale facendo clic su Carica, sfogliando la cartella di registrazione e selezionando uno dei file di dati di picco (.ntt, .nse).
- Seleziona uno o più neuroni che attiveranno la stimolazione facendo clic sulla casella di controllo sotto le forme d'onda tracciate.
- Definisci il numero minimo di neuroni che attiveranno la stimolazione digitando un numero intero nella casella di testo "min matches". Quindi, definire l'intervallo di tempo in cui i picchi che corrispondono a diverse forme d'onda sono considerati coattivi digitando un numero nella casella di testo "finestra".
- Fare clic su Invia per iniziare. Questo avvierà l'attivazione online degli eventi (toni come impostazione predefinita) in base all'attività di spiking dei neuroni selezionati.