Stimolazione optogenetica e registrazione elettrofisiologica di eventi sinaptici in fette di cervello di ratto

Abstract

Fonte: Kinnavane, L., et al. Interrogazione optogenetica ex vivo della trasmissione sinaptica a lungo raggio e della plasticità dalla corteccia prefrontale mediale alla corteccia entorinale laterale. J. Vis. Exp. (2022)

Questo video dimostra la procedura per studiare l'efficienza sinaptica nella corteccia entorinale laterale (LEC) stimolando optogeneticamente gli assoni della corteccia prefrontale mediale (mPFC) e registrando le risposte dei neuroni piramidali nella LEC. Questo metodo combina le registrazioni patch-clamp con l'attivazione sinaptica mediante stimolazione luminosa per studiare la plasticità sinaptica.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Elettrofisiologia e stimolazione optogenetica

1. Identificazione della cellula bersaglio.
   1. Posizionare la fetta in una camera di registrazione sommersa a 34 °C perfusa con liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) a una velocità di 2 mL/min mediante una pompa peristaltica. Immobilizzare la sezione utilizzando un ancoraggio della sezione.
   2. Sotto l'obiettivo a basso ingrandimento (4x) di un microscopio a campo largo che utilizza l'illuminazione obliqua a infrarossi, navigare verso lo strato 5 della corteccia entorinale laterale (LEC). Misurare la distanza dalla superficie del pial allo strato richiesto.
      nota: L'illuminazione obliqua a infrarossi è stata ottenuta posizionando un LED nel vicino infrarosso a circa 3 mm sotto il vetrino coprioggetti della camera di registrazione con un angolo di ~55° rispetto al piano del vetrino coprioggetti (Figura 1B). Il contrasto interferenziale differenziale è una tecnica di imaging alternativa e comunemente utilizzata per l'elettrofisiologia delle fette.
   3. Passa a un obiettivo a immersione in acqua ad alto ingrandimento (40x) e identifica i neuroni piramidali. Segnare la posizione della cella sul monitor del computer con tape.
      nota: I neuroni piramidali hanno una morfologia approssimativamente triangolare con dendriti apicali prominenti che si proiettano verso la superficie piale della fetta (Figura 2A). La salute delle cellule può essere valutata dall'assenza di un nucleo condensato e visibile e dall'ispezione della membrana plasmatica che dovrebbe apparire liscia. È improbabile che la chiara marcatura fluorescente degli assoni da parte della proteina di fusione opsina-fluoroforo sia visibile quando si utilizza un microscopio a fluorescenza ad ampio campo. Per visualizzare le proiezioni assonali, eseguire l'immunoistochimica post-hoc utilizzando un anticorpo primario contro il fluoroforo dell'opsina e amplificare con un anticorpo secondario coniugato a un fluoroforo della stessa lunghezza d'onda o simile.
2. Formazione di patch clamp a cellula intera.​
   1. Fabbricare una micropipetta in vetro borosilicato utilizzando un estrattore per pipette e riempirla con una soluzione di registrazione intracellulare filtrata (120 mM di k-gluconato, 40 mM di HEPES (acido N-2-idrossietilpiperazina-N'-2-etansolfonico), 10 mM di KCl (cloruro di potassio), 2 mM di NaCl (cloruro di sodio), 2 mM di MgATP (adenosina trifosfato di magnesio), 1 mM di MgCl (cloruro di magnesio), 0,3 mM di NaGTP (guanosina trifosfato di sodio), 0,2 mM di EGTA (acido tetraacetico glicole etilenico), e 0,25% di biocitina prodotta in UPW (acqua ultrapura), pH 7,25, 285-300 mOsm). Posizionare la micropipetta riempita nel portaelettrodo sull'headstage dell'amplificatore patch-clamp, assicurandosi che il filo dell'elettrodo sia a contatto con la soluzione intracellulare.
   2. Applicare una pressione positiva per bocca soffiando con forza in un boccaglio (come una siringa da 1 ml con lo stantuffo rimosso) collegato tramite un tubo alla porta laterale del portaelettrodo e mantenere la pressione chiudendo una valvola a tre vie in linea. Sollevare l'obiettivo del microscopio in modo che si formi un menisco e inserire l'elettrodo nel menisco fino a quando non può essere visto sul microscopio.
   3. Aprire la finestra Seal Test in WinLTP16 (o altro software di acquisizione/oscilloscopio) e, con l'amplificatore in modalità voltage-clamp, applicare un impulso quadrato di 5 mV per determinare se la resistenza della pipetta è di 3-6 MΩ.
   4. Avvicinarsi e toccare la cellula identificata con la punta della pipetta; ciò dovrebbe comportare una rientranza nella membrana cellulare (Figura 2A; pannello a destra) e un piccolo aumento della resistenza della pipetta (0,1 MΩ).
   5. Rilasciare la pressione positiva e applicare una pressione negativa applicando un'aspirazione moderata al boccale; ciò dovrebbe comportare un notevole aumento della resistenza della pipetta (>1000 MΩ). La pressione può ora essere lasciata neutra. Applicare una pressione negativa in una rampa gradualmente crescente fino alla rottura della membrana cellulare con conseguente transitorietà della capacità dell'intera cella.
3. Registra eventi sinaptici evocati optogeneticamente.
   1. Immettere la configurazione della pinza di corrente.
      NOTA: Nella maggior parte dei casi, la trasmissione sinaptica a lungo raggio è glutammatergica, quindi la registrazione a potenziali di membrana vicini al potenziale di inversione del cloruro isolerà meglio la trasmissione mediata dal recettore AMPA (AMPAR) e minimizzerà la misurazione di qualsiasi inibizione feed-forward (FFI) evocata. L'inversione del cloruro dipende dalla composizione della soluzione di registrazione intracellulare e dell'aCSF e può essere calcolata utilizzando l'equazione di Goldman-Hodgkin-Katz; per le soluzioni di cui sopra, questo era di -61,3 mV. I neuroni piramidali LEC dello strato 5 avevano un potenziale medio di membrana a riposo di -62 mV e, ove necessario, sono stati mantenuti a questo potenziale mediante iniezione di corrente costante. In alternativa, le celle possono essere bloccate in tensione al potenziale desiderato. Per registrare proiezioni inibitorie a lungo raggio16 o per registrare FFI, voltage-clamp al potenziale di inversione cationica per isolare la conduttanza del cloruro GABAergico. Quando i neuroni voltaggio-clamp a potenziali di membrana superiori alla soglia del potenziale d'azione, viene utilizzata una soluzione intracellulare a base di cesio contenente bloccanti dei canali del sodio voltaggio-dipendenti per migliorare il voltage-clamp e prevenire l'inizio dei potenziali d'azione (130 mM CsMeSO4 (cesio metansolfonato), 10 mM HEPES, 8 mM NaCl, 5 mM QX 314 cloruro, 4 mM MgATP, 0,5 mM EGTA, 0,3 mM NaGTP, 0,25% biocitina prodotta in UPW, pH 7,25, 285-300 mOsm).
   2. Utilizzando il software di acquisizione dati, è possibile inviare segnali TTL (transistor-transistor logic) a un driver LED (diodo a emissione luminosa) per attivare un LED montato a 470 nm. Il LED montato viene diretto nel percorso luminoso del microscopio utilizzando cubi di filtri e ottiche appropriate (Figura 1B) per applicare impulsi luminosi alla fetta tramite l'obiettivo 40x per evocare potenziali post-sinaptici eccitatori optogenetici (oEPSP).
      nota: Gli impulsi luminosi possono essere applicati perisomaticamente/sopra i dendriti, il che comporterà l'attivazione delle opsine negli assoni e nel botone presinaptico, oppure l'investigatore può spostare l'obiettivo verso gli assoni lontano dalla cellula registrata per evitare una stimolazione eccessiva del bottone. L'ampiezza massima dell'oEPSP dipende dalla forza della proiezione sinaptica, dall'efficacia delle iniezioni virali e dall'opsina utilizzata. oGli EPSP possono essere titolati all'ampiezza desiderata variando l'intensità e/o la durata della luce18; variando la durata degli impulsi luminosi (durata tipica compresa tra 0,2 e 5 ms alla massima potenza del LED, che si traduce in una densità luminosa di 4,4 mW/mm19) si ottengono ampiezze oEPSP più coerenti rispetto alla modifica della potenza in uscita del LED.
   3. Studiare le proprietà di rilascio presinaptico (variazione di tensione) erogando treni di impulsi luminosi multipli con diversi intervalli interstimolo (Figura 2E); occorre prestare attenzione nell'interpretazione della trasmissione evocata optogeneticamente.
   4. Studiare la plasticità a lungo termine evocando ripetutamente oEPSPs19 o applicando leganti. Monitorare l'ampiezza dell'EPSP per 5-10 minuti per garantire la stabilità prima dell'induzione della plasticità, quindi monitorare fino a raggiungere un'ampiezza stabile (in genere 30-40 minuti).
      nota: La maggior parte delle opsine attuali non sono in grado di evocare in modo affidabile più potenziali d'azione ad alte frequenze, ad esempio 100 stimoli erogati a 100 Hz, come viene tipicamente utilizzato per indurre LTP.
   5. Per confermare che le oEPSP sono monosinaptiche, eseguire l'attivazione over-bouton della via trasdotta posizionando l'obiettivo sopra l'albero dendritico e stimolando in presenza di 0,5 μM di tetrodotossina e 100 μM di aminopiridina. L'applicazione della tetrodotossina abolirà la trasmissione se le risposte sono dipendenti dal potenziale d'azione, e la successiva inclusione di aminopiridina ripristinerà parzialmente la trasmissione se gli oEPSP sono generati monosinapticamente19,20.
   6. Per consentire alla biocitina di riempire il neurone, attendere almeno 15 minuti dopo essere entrati nella configurazione dell'intera cellula. In voltage-clamp, monitorare la capacità della membrana e la resistenza di ingresso.
   7. Estrarre lentamente la pipetta lungo l'angolo di avvicinamento lontano dal soma della cellula, osservando la lenta scomparsa dei transitori di capacità e della corrente di membrana, indicando la risigillatura della membrana cellulare e la formazione di un cerotto esterno verso l'esterno sulla punta della pipetta. Prendere nota dell'orientamento della sezione e della posizione delle celle all'interno della sezione. Mettere la fetta in PFA (paraformaldeide) in una piastra a 24 pozzetti, incubare per una notte a 4 °C e quindi trasferire a 0,1 M PB.
      nota: Le fette possono essere conservate fino a una settimana. Se è necessaria una conservazione più lunga, sostituire regolarmente il PB (tampone fosfato) o utilizzare PB contenente sodio azide (0,02%-0,2% di sodio azide).

Risultati

Figura 1: Camera di raccolta delle fette e configurazione ottica per la visualizzazione di registrazioni di cellule intere, eccitazione optogenetica e identificazione di neuroni tdTomato-positivi. (A) La camera di raccolta delle fette14 è realizzata su misura da un rack per provette da microcentrifuga incollato su un foglio di rete di nylon e inserito in un becher in cui è immerso in...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Valvola luer a 3 vie	Cole-Parmer	WZ-30600-02
Obiettivo 40x	Olimpo	LUMPLFLN40XW
4-amminopiridina	Ciao Biografia	HB1073
Obiettivo 4x	Olimpo	PLN4X/0.1
Lente acromatica	Edmund Optics	Numero 49363	Focalizza lo spettro visivo e il vicino infrarosso
Microcentrifuga da banco	Benchmark scientifico	C1005*
Biocitina	Sigma-Aldrich	B4261
Capillare in vetro borosillicato	Strumenti Warner	G150F-6
CaCl2	Sigma-Aldrich	Codice: C5670
Fotocamera - Qimaging Retiga Electro	Fotometria	01-ELECTRO-M-14-C
Carbachol	Tocris	2810
Scrub chirurgico alla clorexidina	Vetasept	XHG008
Clippers	Andis	Codice 22445	AGC Super 2 velocità Tagliacapelli a lama staccabile
Lente del condensatore di collimazione	ThorLabs	ACL2520-A
Vetrini coprioggetti	Fisher Scientific Ltd	10011913
criostato	Leica	CM3050 S
CsMeSO4	Sigma-Aldrich	C1426
Colla cianoacrilica	Elettronica rapida Ltd	84-4557
Dispositivo di acquisizione dati	Strumenti nazionali	USB-6341 BNC
D-glucosio	Sigma-Aldrich	G8270
Specchio dicroico 500 nm passa-lungo	Edmund Optics	Codice 69899
Specchio dicroico 600 nm passa-lungo	Edmund Optics	Codice 69901
Cubo specchio dicroico	ThorLabs	CM1-DCH/M
EGTA	Millpore	324626
Portaelettrodo con porta laterale	HEKA	Codice 895150
Filtro di emissione	Chroma	59022m
Filtro di eccitazione	Chroma	ET570/20x
Gel per gli occhi	Dechra	Lubrithal
Pennello fine	Forniture per laboratori scientifici	BRU2052
ghigliottina	Strumenti di precisione mondiali	DCAP
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Soluzione di perossido di idrogeno	Sigma-Aldrich	H1009	30% (p/p)
Isoflurano	Henry Schein	988-3245
Isopentano	Sigma-Aldrich	Codice: M32631
Kcl	Sigma-Aldrich	P3911
K-gluconato	Sigma-Aldrich	G4500
Cubo filtrante a fluorescenza cinematica	ThorLabs	DFM1T1
Driver LED	ThorLabs	LEDD1B
MgATP	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale A9187
MgCl	Sigma-Aldrich	Motore M2670
MgSO4	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale M7506
Estrattore per microelettrodi	Strumenti Sutter	P-87
Siringa per microiniezione	Hamilton	7634-01/00
Ago per siringa per microiniezione	Hamilton	Codice: 7803-05	Specifiche personalizzate: calibro 33, lunghezza 15 mm, tipo punta 4 - 12°
Pompa a siringa per microiniezione	Strumenti di precisione mondiali	UMP3T-1
LED blu montato	ThorLabs	Codice: M470L5
Na2HPO4.7H2O	Sigma-Aldrich	S9390
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaGTP	Sigma-Aldrich	G8877
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S0751
NaH2PO4.H2O	Sigma-Aldrich	S9638
NaHCO3	Sigma-Aldrich	Episodio 5761
LED NIR	OSRAM	SFH4550	Utilizzata per l'imaging IR rifratto di slice, l'ottica a contrasto interferenziale differenziale (DIC) è un altro metodo comunemente usato
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	158127
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	P6148
Amplificatore patch clamp	Dispositivi molecolari	700A
Pompa peristaltica	Strumenti di precisione mondiali	Ministar
Vetrini per microscopio rivestiti in poli-L-lisina	Fisher Scientific Ltd	23-769-310
Camera di registrazione	Strumenti Warner	RC-26G
Ancoraggio di sezione	Strumenti Warner	SHD-26-GH/15
Supporto stereotassico per micro trapano	Apparato di Harvard	75-1874
saccarosio	Sigma-Aldrich	S0389
Microscopio operatorio	Carl Zeiss	OPMI 1 FR pro
Filtro a siringa per soluzione di registrazione intracellulare	Thermo Scientific Nalgene	Codice 171-0020
Microscopio a fluorescenza verticale	Leica	DM6 B
soluzione
aCSF
soluzione di taglio del saccarosio
PFA