Carico e scarico del colorante FM mediato da microelettrodi nelle cellule nervose delle larve di Drosophila

Abstract

Fonte: Kopke, D. L., et al., FM dye cycling at the synapse: confronto tra elevata depolarizzazione del potassio, stimolazione elettrica e canalrodopsina. J. Vis. Exp. (2018)

In questo video, le fibre nervose delle larve di Drosophila sono immerse in un colorante FM, che si lega ai lipidi della membrana cellulare. Il microelettrodo di aspirazione e gli impulsi elettrici stimolano il processo di endocitosi, incorporando il colorante FM nelle vescicole endocitiche di nuova formazione. Questo metodo, che visualizza le fasi presinaptiche della neurotrasmissione, è utile per studiare la funzione sinaptica e il rilascio di neurotrasmettitori.

Protocollo

1. Dissezione della Colla Larvale

1. Mescolare accuratamente 10 parti di base in elastomero siliconico con 1 parte di agente indurente in elastomero siliconico del kit di elastomeri.
2. Rivestire i vetrini coprioggetto da 22 x 22 mm con l'elastomero e polimerizzare su una piastra calda a 75 °C per diverse ore (fino a quando non è più appiccicoso al tatto).
3. Posizionare un singolo vetrino coprioggetti rivestito in elastomero nella camera di dissezione in plexiglass su misura per la dissezione larvale.
4. Preparare le pipette di colla dal capillare di vetro borosilicato utilizzando un estrattore per microelettrodi standard per ottenere la conicità e la dimensione della punta desiderate.
5. Staccare delicatamente il puntale della micropipetta e, all'altra estremità, collegare 2 piedi di tubo di plastica flessibile (diametro interno 1/32", ID; diametro esterno 3/32", diametro esterno; parete 1/32"; con raccordo bocca (punta della pipetta P2).
6. In preparazione alla dissezione larvale, riempire un piccolo contenitore (tappo della provetta Eppendorf da 0,6 mL) con un piccolo volume (~20 μL) di colla.
7. Riempire la camera con soluzione fisiologica (in mM): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl₂, 1 CaCl₂, 70 saccarosio e 5 acido 2-[4-(2-idrossietil)piperazin-1-il]etansolfonico (HEPES) pH 7,2.
8. Aggiungere l'anticorpo anti-perossidasi di rafano (HRP) coniugato ad Alexa Fluor 647 (anti-HRP:647; diluito 1:10 da un ceppo da 1 mg/mL) per marcare il terminale presinaptico NMJ durante la dissezione21,22.
9. Utilizzando un pennello fine (misura 2), rimuovere un terzo stadio vagante dalla fiala di cibo e posizionarlo sul vetro di copertura rivestito in elastomero.
10. Riempire il puntale della micropipetta di vetro con un piccolo volume di colla utilizzando la pressione negativa dell'aria generata dalla bocca con attacco (passaggio 1.5).
11. Posizionare la larva con la pincipe con la parte dorsale rivolta verso l'alto e incollare la testa al vetrino coprioggetti rivestito in elastomero con una piccola goccia di colla utilizzando una pressione positiva dell'aria per bocca.
12. Ripeti questa procedura con l'estremità posteriore della larva, assicurandoti che l'animale sia teso tra i due attacchi di colla.
13. Utilizzando le forbici (lame da 3 mm), eseguire un taglio orizzontale (~1 mm) nella parte posteriore e un taglio verticale lungo tutta la linea mediana dorsale.
14. Usando una pinza fine (#5), rimuovere delicatamente la trachea dorsale, l'intestino, il corpo adiposo e altri organi interni che coprono la muscolatura.
15. Ripetere la procedura di incollaggio per le quattro alette della parete del corpo; tendere delicatamente la parete del corpo orizzontalmente e verticalmente.
16. Sollevare il cordone nervoso ventrale (VNC) usando una pinza, tagliare con cura i nervi motori con le forbici, quindi rimuovere completamente il VNC.
17. Per interrompere il ciclo SV, sostituire la soluzione salina di dissezione con soluzione fisiologica priva di Ca²⁺ (la stessa della soluzione salina di dissezione sopra senza CaCl₂).

2. Stimolazione elettrica Caricamento del colorante FM

1. Preparare una pipetta di aspirazione utilizzando l'estrattore per microelettrodi per ottenere la conicità e la dimensione del puntale richieste.
2. Lucidare a fuoco la punta del microelettrodo con una micro-forgia fino a quando un singolo nervo motore può essere aspirato con una perfetta aderenza.
3. Far scorrere la pipetta di aspirazione sul supporto dell'elettrodo di un micromanipolatore e fissarla al lungo tubo flessibile di plastica e a una siringa.
4. Impostare i parametri dello stimolatore (ad es. 15 V, frequenza 20 Hz, durata 20 ms e tempo di 5 min o 1 min.
5. Sostituire la soluzione salina priva di Ca²⁺ nella preparazione larvale con la soluzione salina FM1-43 di cui sopra (4 μM; 1 mM CaCl₂) nel rig di elettrofisiologia.
6. Mettere il preparato sul tavolino del microscopio e sollevare il tavolino fino a mettere a fuoco la larva e la pipetta di aspirazione (obiettivo a immersione in acqua 40X).
7. Aspirare nell'elettrodo di aspirazione un'ansa del nervo motore tagliato che innerva l'emisegmento selezionato con una pressione dell'aria negativa generata dalla siringa.
8. Testare la funzione dell'elettrodo di aspirazione con una breve stimolazione monitorando visivamente la contrazione muscolare nell'emisegmento selezionato.
9. Stimolare il nervo motore utilizzando parametri selezionati (passaggio 2.4) per guidare l'endocitosi SV e l'assorbimento del colorante FM1-43.
10. Lavare rapidamente con soluzione fisiologica priva di Ca²⁺ (5 volte per 1 min) per rimuovere completamente la soluzione colorante FM1-43.
11. Mantenere la preparazione larvale in soluzione salina fresca priva di Ca²⁺ per l'imaging immediato utilizzando il protocollo di imaging confocale dall'alto.
12. Prendere nota dell'immagine NMJ (segmento, lato e muscolo) per garantire l'accesso allo stesso NMJ dopo lo scarico del colorante FM.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
SylGard 184 Kit di elastomeri siliconici	Fisher Scientifico	NC9644388	Da applicare sul vetro di copertura per le dissezioni
Vetro di copertura del microscopio 22x22-1	Fisherbrand	12-542-B	Per applicare SylGard per le dissezioni
Piastra riscaldante superiore in alluminio tipo 2200	Thermolyne	HPA2235M	Per curare il SylGard
Camera di dissezione in plexiglass	N/A	N/A	fatto a mano
Capillari in vetro borosilicato	WPI	1B100F-4	Per effettuare micropipette di aspirazione e colla
Estrattore per micropipette basato su laser	Strumento Sutter	P-2000	Per effettuare micropipette di aspirazione e colla
Tygon E-3603 Tubi da laboratorio	Fornitura di componenti Co.	TET-031A	Per pipetta per bocca e aspirazione
Puntale per pipetta P2	Stati Uniti d'America Scientific	Codice 1111-3700	Per pipetta orale
Tappo della provetta Eppendorf da 0,6 mL	Fisher Scientifico	05-408-120	Usato per mettere la colla per la dissezione
Vetbond 3M	WPI	Certificato	Colla utilizzata per le dissezioni
cloruro di potassio	Fisher Scientifico	P-217	Forsaline
cloruro di sodio	Millipore Sigma	S5886	Per soluzione salina
cloruro di magnesio	Fisher Scientifico	Visualizzazione del materiale M35-500	Per soluzione salina
Cloruro di calcio diidrato	Millipore Sigma	Visualizzazione del materiale C7902	Per soluzione salina
saccarosio	Fisher Scientifico	S5-3	Per soluzione salina
HEPES	Millipore Sigma	H3375	Per soluzione salina
HRP:Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	Codice 123-605-021	Per marcare le membrane neuronali
pennello	Winsor & Newton	94376864793	Per manipolare le larve
Dumont Dumostar Pinzetta #5	WPI	500233	Utilizzato durante la dissezione
Microforbici McPherson-Vannas da 7 cm (lame da 3 mm)	WPI	Codice: 14177	Utilizzato durante la dissezione
FM1-43	Fisher Scientifico	T35356	Colorante fluorescente allo stirile
Timer digitale	VWR	Codice 62344-641	Per la temporizzazione del carico/scarico del colorante FM
Micro-Forgia	WPI	MF200	Per lucidare a fuoco le micropipette di vetro
20mL siringa punta scorrevole	Bd	301625	Per aspirare l'assone per la stimolazione elettrica.
Micro manipolatore (base magnetica)	Narishige	MMN-9	Per controllare l'elettrodo di aspirazione per la stimolazione elettrica
Stimolatore	erba	S48	Per controllare il LED e la stimolazione elettrica
Microscopio Zeiss Axioskop	Zeiss		Utilizzato durante la stimolazione elettrica.
Obiettivo ad immersione in acqua 40X Achroplan	Zeiss		Utilizzato durante la stimolazione elettrica e l'imaging confocale
Microscopio Zeiss Stemi con porta fotocamera	Zeiss	Anno 2000-C	Utilizzato durante la stimolazione con canalrodopsina
Driver LED T-Cube	ThorLabs	LEDD1B	Per controllare il LED
Alimentazione LED	Cincon Electronics Co.	TR15RA150	Per alimentare il LED
Contatore ottico di potenza ed energia	ThorLabs	PM100D	Per misurare l'intensità del LED