1. Dissezione della Colla Larvale
- Mescolare accuratamente 10 parti di base in elastomero siliconico con 1 parte di agente indurente in elastomero siliconico dal kit di elastomeri (Tabella dei materiali).
- Rivestire i vetrini coprioggetto da 22 x 22 mm con l'elastomero e polimerizzare su una piastra calda a 75 °C per diverse ore (fino a quando non è più appiccicoso al tatto).
- Posizionare un singolo vetrino coprioggetti in vetro rivestito in elastomero nella camera di dissezione in plexiglass su misura (Figura 1, in basso) in preparazione per la dissezione larvale.
- Preparare le pipette di colla dal capillare di vetro borosilicato utilizzando un estrattore per microelettrodi standard per ottenere la conicità e la dimensione della punta desiderate.
- Staccare delicatamente la punta della micropipetta e, all'altra estremità, collegare 2 piedi di tubo di plastica flessibile (diametro interno 1/32", ID; diametro esterno 3/32", OD; parete 1/32"; Tabella dei materiali) con raccordo per bocca (punta della pipetta P2).
- Riempire un piccolo contenitore (tappo della provetta Eppendorf da 0,6 mL) con un piccolo volume (~20 μL) di colla (Tabella dei materiali) in preparazione per la dissezione larvale.
- Riempire la camera con soluzione fisiologica (in mM): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl2, 1 CaCl2, 70 saccarosio e 5 acido 2-[4-(2-idrossietil)piperazin-1-il]etansolfonico (HEPES) pH 7,2.
- Aggiungere l'anticorpo anti-perossidasi di rafano (HRP) coniugato ad Alexa Fluor 647 (anti-HRP:647; diluito 1:10 da un stock da 1 mg/mL) per marcare il terminale presinaptico della giunzione neuromuscolare (NMJ) durante la dissezione.
- Utilizzando un pennello fine (misura 2), rimuovere una larva di terzo stadio vagante dal flaconcino di cibo e posizionarla sul vetro di copertura rivestito in elastomero.
- Riempire il puntale della micropipetta di vetro con un piccolo volume di colla utilizzando la pressione negativa dell'aria generata dalla bocca con l'attacco (passaggio 1.5).
- Posizionare la larva con la parte dorsale rivolta verso l'alto con una pinza e incollare la testa al vetrino coprioggetti rivestito in elastomero con una piccola goccia di colla utilizzando una pressione positiva dell'aria per bocca.
- Ripeti questa procedura con l'estremità posteriore della larva, assicurandoti che l'animale sia teso tra i due attacchi di colla.
- Utilizzando le forbici (lame da 3 mm; Tabella dei materiali), eseguire un taglio orizzontale (~1 mm) nella parte posteriore e un taglio verticale lungo tutta la linea mediana dorsale.
- Utilizzando una pinza fine (#5, Tabella dei materiali), rimuovere delicatamente la trachea dorsale, l'intestino, il corpo adiposo e altri organi interni che coprono la muscolatura.
- Ripetere la procedura di incollaggio per i quattro lembi della parete del corpo, assicurandosi di allungare delicatamente la parete del corpo sia orizzontalmente che verticalmente.
- Sollevare il cordone nervoso ventrale (VNC) usando una pinza, tagliare con cura i nervi motori con le forbici, quindi rimuovere completamente il VNC.
- Sostituire la soluzione salina di dissezione con soluzione fisiologica priva di Ca2+ (la stessa della soluzione salina di dissezione sopra senza il CaCl2) per fermare il ciclo della vescicola sinaptica (SV).
2. Imaging: Microscopia confocale
- Utilizzare un microscopio confocale verticale con un obiettivo a immersione in acqua 40X per visualizzare la fluorescenza del colorante NMJ (è possibile utilizzare altri microscopi).
- Acquisire l'immagine del muscolo 4 NMJ dei segmenti addominali 2-4 (è possibile visualizzare altri NMJ) e raccogliere le immagini utilizzando un software appropriato (Tabella dei materiali).
- Utilizzare un laser HeNe 633 nm per eccitare HRP:647 (con filtro passa-lungo > 635 nm) e un laser Argon 488 nm per eccitare FM1-43 (con filtro passa-banda 530-600 nm).
- Determinare operativamente il guadagno e l'offset ottimali per entrambi i canali.
nota: Queste impostazioni rimarranno costanti per tutto il resto dell'esperimento.
- Prendi uno Z-stack confocale attraverso l'intero NMJ selezionato dall'alto verso il basso del terminale sinaptico contrassegnato con HRP.
- Prendere nota dell'NMJ ripreso (segmento, lato e muscolo) per garantire un eccesso dello stesso NMJ dopo lo scarico del colorante FM.
3. Stimolazione con canalrodopsina Caricamento del colorante FM
- Allevare larve che esprimono ChR2 su alimenti contenenti il cofattore ChR2 all-trans retinal (disciolto in etanolo; concentrazione finale di 100 μM).
- Posizionare il preparato larvale nella camera di plexiglass su un tavolino per microscopio di dissezione dotato di una porta per telecamera.
- Collegare un LED blu (470 nm; Tabella dei materiali) a uno stimolatore programmabile utilizzando un cavo coassiale e posizionare il LED nella porta della fotocamera.
- Focalizzare il fascio di luce LED blu sulla funzione larvale sezionata utilizzando la funzione di zoom del microscopio.
- Sostituire la soluzione salina libera da Ca2+ sulla preparazione larvale con la soluzione fisiologica FM1-43 di cui sopra (4 μM; 1 mM CaCl2) nella fase optogenetica.
- Impostare i parametri LED utilizzando lo stimolatore (ad es. 15 V, frequenza 20 Hz, durata 20 ms e tempo di 5 min (Figura 2)).
- Avviare la stimolazione luminosa e tracciarla con un timer per la durata predeterminata del periodo di stimolazione optogenetica (ad esempio, 5 min; Figura 2).
- Quando il timer si ferma, rimuovere rapidamente la soluzione colorante FM e sostituirla con soluzione fisiologica priva di Ca2+ per arrestare il ciclo SV.
- Lavare in rapida successione con la soluzione salina priva di Ca2+ (5 volte per 1 min) per assicurarsi che la soluzione colorante FM sia completamente rimossa.
- Mantenere la preparazione larvale in soluzione salina fresca priva di Ca2+ per l'imaging immediato con il microscopio confocale utilizzando il protocollo di imaging.
- Prendere nota dell'NMJ ripreso (segmento, lato e muscolo) per garantire l'accesso allo stesso NMJ dopo lo scarico del colorante FM.
4. Stimolazione della canalrodopsina: scarico del colorante FM
- Sostituire la soluzione fisiologica priva di Ca2+ con soluzione fisiologica normale (senza colorante FM1-43) sul tavolino del microscopio di dissezione con il LED della porta della fotocamera focalizzato sulla larva.
- Impostare i parametri dello stimolatore per lo scarico (ad es. 15 V, frequenza 20 Hz, durata 20 ms e tempo di 2 min (Figura 2).
- Avviare la stimolazione luminosa e seguirla con un timer per la durata predeterminata del periodo di stimolazione optogenetica (ad esempio, 2 min; Figura 2).
- Al termine del periodo del timer, rimuovere rapidamente la soluzione colorante FM e sostituirla con soluzione salina priva di Ca2+ per interrompere il ciclo SV.
- Lavare in rapida successione con soluzione fisiologica priva di Ca2+ (5 volte per 1 min) per assicurarsi che il colorante esterno sia completamente rimosso.
- Mantenere la preparazione larvale in soluzione salina fresca priva di Ca2+ per l'imaging immediato con il microscopio confocale.
- Assicurarsi di visualizzare la fluorescenza del colorante FM1-43 allo stesso NMJ indicato sopra utilizzando le stesse impostazioni confocali.
