Analisi del riciclaggio delle vescicole sinaptiche e dell'assorbimento del colorante fluorescente nelle larve di Drosophila

Abstract

Fonte: Kopke, D. L., et al., FM Ciclo del colorante alla sinapsi: confronto tra alta depolarizzazione del potassio, stimolazione elettrica e canalrodopsina. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video dimostra un protocollo per studiare il riciclaggio delle vescicole sinaptiche alle giunzioni neuromuscolari nelle larve di Drosophila che esprimono canalrodopsina utilizzando un colorante fluorescente. La luce blu attiva le canalrodopsine, causando l'afflusso di calcio e l'esocitosi delle vescicole sinaptiche. Il colorante si integra nelle membrane neuronali e viene internalizzato durante l'endocitosi, con conseguente miglioramento della fluorescenza. Un'ulteriore stimolazione della luce blu induce esocitosi e rilascio di colorante, che è dimostrato dalla ridotta fluorescenza.

Protocollo

1. Dissezione della Colla Larvale

1. Mescolare accuratamente 10 parti di base in elastomero siliconico con 1 parte di agente indurente in elastomero siliconico dal kit di elastomeri (Tabella dei materiali).
2. Rivestire i vetrini coprioggetto da 22 x 22 mm con l'elastomero e polimerizzare su una piastra calda a 75 °C per diverse ore (fino a quando non è più appiccicoso al tatto).
3. Posizionare un singolo vetrino coprioggetti in vetro rivestito in elastomero nella camera di dissezione in plexiglass su misura (Figura 1, in basso) in preparazione per la dissezione larvale.
4. Preparare le pipette di colla dal capillare di vetro borosilicato utilizzando un estrattore per microelettrodi standard per ottenere la conicità e la dimensione della punta desiderate.
5. Staccare delicatamente la punta della micropipetta e, all'altra estremità, collegare 2 piedi di tubo di plastica flessibile (diametro interno 1/32", ID; diametro esterno 3/32", OD; parete 1/32"; Tabella dei materiali) con raccordo per bocca (punta della pipetta P2).
6. Riempire un piccolo contenitore (tappo della provetta Eppendorf da 0,6 mL) con un piccolo volume (~20 μL) di colla (Tabella dei materiali) in preparazione per la dissezione larvale.
7. Riempire la camera con soluzione fisiologica (in mM): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl₂, 1 CaCl₂, 70 saccarosio e 5 acido 2-[4-(2-idrossietil)piperazin-1-il]etansolfonico (HEPES) pH 7,2.
8. Aggiungere l'anticorpo anti-perossidasi di rafano (HRP) coniugato ad Alexa Fluor 647 (anti-HRP:647; diluito 1:10 da un stock da 1 mg/mL) per marcare il terminale presinaptico della giunzione neuromuscolare (NMJ) durante la dissezione.
9. Utilizzando un pennello fine (misura 2), rimuovere una larva di terzo stadio vagante dal flaconcino di cibo e posizionarla sul vetro di copertura rivestito in elastomero.
10. Riempire il puntale della micropipetta di vetro con un piccolo volume di colla utilizzando la pressione negativa dell'aria generata dalla bocca con l'attacco (passaggio 1.5).
11. Posizionare la larva con la parte dorsale rivolta verso l'alto con una pinza e incollare la testa al vetrino coprioggetti rivestito in elastomero con una piccola goccia di colla utilizzando una pressione positiva dell'aria per bocca.
12. Ripeti questa procedura con l'estremità posteriore della larva, assicurandoti che l'animale sia teso tra i due attacchi di colla.
13. Utilizzando le forbici (lame da 3 mm; Tabella dei materiali), eseguire un taglio orizzontale (~1 mm) nella parte posteriore e un taglio verticale lungo tutta la linea mediana dorsale.
14. Utilizzando una pinza fine (#5, Tabella dei materiali), rimuovere delicatamente la trachea dorsale, l'intestino, il corpo adiposo e altri organi interni che coprono la muscolatura.
15. Ripetere la procedura di incollaggio per i quattro lembi della parete del corpo, assicurandosi di allungare delicatamente la parete del corpo sia orizzontalmente che verticalmente.
16. Sollevare il cordone nervoso ventrale (VNC) usando una pinza, tagliare con cura i nervi motori con le forbici, quindi rimuovere completamente il VNC.
17. Sostituire la soluzione salina di dissezione con soluzione fisiologica priva di Ca²⁺ (la stessa della soluzione salina di dissezione sopra senza il CaCl₂) per fermare il ciclo della vescicola sinaptica (SV).

2. Imaging: Microscopia confocale

1. Utilizzare un microscopio confocale verticale con un obiettivo a immersione in acqua 40X per visualizzare la fluorescenza del colorante NMJ (è possibile utilizzare altri microscopi).
2. Acquisire l'immagine del muscolo 4 NMJ dei segmenti addominali 2-4 (è possibile visualizzare altri NMJ) e raccogliere le immagini utilizzando un software appropriato (Tabella dei materiali).
3. Utilizzare un laser HeNe 633 nm per eccitare HRP:647 (con filtro passa-lungo > 635 nm) e un laser Argon 488 nm per eccitare FM1-43 (con filtro passa-banda 530-600 nm).
4. Determinare operativamente il guadagno e l'offset ottimali per entrambi i canali.
   nota: Queste impostazioni rimarranno costanti per tutto il resto dell'esperimento.
5. Prendi uno Z-stack confocale attraverso l'intero NMJ selezionato dall'alto verso il basso del terminale sinaptico contrassegnato con HRP.
6. Prendere nota dell'NMJ ripreso (segmento, lato e muscolo) per garantire un eccesso dello stesso NMJ dopo lo scarico del colorante FM.

3. Stimolazione con canalrodopsina Caricamento del colorante FM

1. Allevare larve che esprimono ChR2 su alimenti contenenti il cofattore ChR2 all-trans retinal (disciolto in etanolo; concentrazione finale di 100 μM).
2. Posizionare il preparato larvale nella camera di plexiglass su un tavolino per microscopio di dissezione dotato di una porta per telecamera.
3. Collegare un LED blu (470 nm; Tabella dei materiali) a uno stimolatore programmabile utilizzando un cavo coassiale e posizionare il LED nella porta della fotocamera.
4. Focalizzare il fascio di luce LED blu sulla funzione larvale sezionata utilizzando la funzione di zoom del microscopio.
5. Sostituire la soluzione salina libera da Ca²⁺ sulla preparazione larvale con la soluzione fisiologica FM1-43 di cui sopra (4 μM; 1 mM CaCl₂) nella fase optogenetica.
6. Impostare i parametri LED utilizzando lo stimolatore (ad es. 15 V, frequenza 20 Hz, durata 20 ms e tempo di 5 min (Figura 2)).
7. Avviare la stimolazione luminosa e tracciarla con un timer per la durata predeterminata del periodo di stimolazione optogenetica (ad esempio, 5 min; Figura 2).
8. Quando il timer si ferma, rimuovere rapidamente la soluzione colorante FM e sostituirla con soluzione fisiologica priva di Ca²⁺ per arrestare il ciclo SV.
9. Lavare in rapida successione con la soluzione salina priva di Ca²⁺ (5 volte per 1 min) per assicurarsi che la soluzione colorante FM sia completamente rimossa.
10. Mantenere la preparazione larvale in soluzione salina fresca priva di Ca²⁺ per l'imaging immediato con il microscopio confocale utilizzando il protocollo di imaging.
11. Prendere nota dell'NMJ ripreso (segmento, lato e muscolo) per garantire l'accesso allo stesso NMJ dopo lo scarico del colorante FM.

4. Stimolazione della canalrodopsina: scarico del colorante FM

1. Sostituire la soluzione fisiologica priva di Ca²⁺ con soluzione fisiologica normale (senza colorante FM1-43) sul tavolino del microscopio di dissezione con il LED della porta della fotocamera focalizzato sulla larva.
2. Impostare i parametri dello stimolatore per lo scarico (ad es. 15 V, frequenza 20 Hz, durata 20 ms e tempo di 2 min (Figura 2).
3. Avviare la stimolazione luminosa e seguirla con un timer per la durata predeterminata del periodo di stimolazione optogenetica (ad esempio, 2 min; Figura 2).
4. Al termine del periodo del timer, rimuovere rapidamente la soluzione colorante FM e sostituirla con soluzione salina priva di Ca²⁺ per interrompere il ciclo SV.
5. Lavare in rapida successione con soluzione fisiologica priva di Ca²⁺ (5 volte per 1 min) per assicurarsi che il colorante esterno sia completamente rimosso.
6. Mantenere la preparazione larvale in soluzione salina fresca priva di Ca²⁺ per l'imaging immediato con il microscopio confocale.
7. Assicurarsi di visualizzare la fluorescenza del colorante FM1-43 allo stesso NMJ indicato sopra utilizzando le stesse impostazioni confocali.

Risultati

Figura 1: Diagramma di flusso del protocollo di caricamento del colorante FM1-43 presso l'NMJ di Drosophila. La dissezione con colla larvale produce una preparazione di neuromuscolatura appiattita, con il cordone nervoso ventrale (VNC) che proietta i nervi segmentali dalla linea mediana ventrale (Vm) agli array muscolari della parete corporea ripetuti emisegmentalmente (fase a). Il VNC viene tagliato...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
SylGard 184 Kit di elastomeri siliconici	Fisher Scientifico	NC9644388	Da applicare sul vetro di copertura per le dissezioni
Vetro di copertura del microscopio 22x22-1	Fisherbrand	12-542-B	Per applicare SylGard per le dissezioni
Piastra riscaldante superiore in alluminio tipo 2200	Thermolyne	HPA2235M	Per curare il SylGard
Camera di dissezione in plexiglass	N/A	N/A	fatto a mano
Capillari in vetro borosilicato	WPI	1B100F-4	Per effettuare micropipette di aspirazione e colla
Estrattore per micropipette basato su laser	Strumento Sutter	P-2000	Per effettuare micropipette di aspirazione e colla
Tygon E-3603 Tubi da laboratorio	Fornitura di componenti Co.	TET-031A	Per pipetta per bocca e aspirazione
Puntale per pipetta P2	Stati Uniti d'America Scientific	Codice 1111-3700	Per pipetta orale
Tappo della provetta Eppendorf da 0,6 mL	Fisher Scientifico	05-408-120	Usato per mettere la colla per la dissezione
Vetbond 3M	WPI	Certificato	Colla utilizzata per le dissezioni
cloruro di potassio	Fisher Scientifico	P-217	Forsaline
cloruro di sodio	Millipore Sigma	S5886	Per soluzione salina
cloruro di magnesio	Fisher Scientifico	Visualizzazione del materiale M35-500	Per soluzione salina
Cloruro di calcio diidrato	Millipore Sigma	Visualizzazione del materiale C7902	Per soluzione salina
saccarosio	Fisher Scientifico	S5-3	Per soluzione salina
HRP:Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	Codice 123-605-021	Per marcare le membrane neuronali
HEPES	Millipore Sigma	H3375	Per soluzione salina
pennello	Winsor & Newton	94376864793	Per manipolare le larve
Dumont Dumostar Pinzetta #5	WPI	500233	Utilizzato durante la dissezione
Microforbici McPherson-Vannas da 7 cm (lame da 3 mm)	WPI	Codice: 14177	Utilizzato durante la dissezione
FM1-43	Fisher Scientifico	T35356	Colorante fluorescente allo stirile
Timer digitale	VWR	Codice 62344-641	Per la temporizzazione del carico/scarico del colorante FM
Microscopio confocale a scansione laser LSM 510 META	Zeiss		Per l'imaging dei marcatori fluorescenti
Zen 2009 SP2 versione 6.0	Zeiss		Software per l'imaging su confocale
Laser HeNe 633nm	Lasos	Per eccitare HRP:647 durante l'imaging
Laser ad argon 488nm	Lasos		Per eccitare il colorante FM durante l'imaging
Micro-Forgia	WPI	MF200	Per lucidare a fuoco le micropipette di vetro
Stimolatore	erba	S48	Per controllare il LED e la stimolazione elettrica
All-trans Retinal	Millipore Sigma	R2500	Co-fattore essenziale per ChR2
Microscopio Zeiss Stemi con porta fotocamera	Zeiss	Anno 2000-C	Utilizzato durante la stimolazione con canalrodopsina
LED 470nm	ThorLabs	Codice: M470L2	Utilizzato per l'attivazione di ChR
Driver LED T-Cube	ThorLabs	LEDD1B	Per controllare il LED
Alimentazione LED	Cincon Electronics Co.	TR15RA150	Per alimentare il LED
Contatore ottico di potenza ed energia	ThorLabs	PM100D	Per misurare l'intensità del LED
Obiettivo ad immersione in acqua 40X Achroplan	Zeiss	Utilizzato durante la stimolazione elettrica e l'imaging confocale