Impianto di un elettrodo nel nucleo subtalamico di un ratto

Abstract

Fonte: Fluri, F., et al., Impianto guidato da microelettrodi di elettrodi nel nucleo subtalamico di ratti per la stimolazione cerebrale profonda a lungo termine. J. Vis. Exp. (2015)

Il video mostra una procedura per impiantare un elettrodo nel nucleo subtalamico di un ratto per fornire stimoli elettrici.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Anestesia

1. Controllare il sistema anestetico per garantire un adeguato apporto di gas (ossigeno) e isoflurano per tutta la durata della procedura. Collegare l'ogiva con la barra incisiva dello strumento stereotassico e impostare la barra incisiva a -3,3 mm.
2. Aprire l'alimentazione del gas (2 L/min). Metti il topo in una scatola e sigilla la parte superiore. Accendi il vaporizzatore di isoflurano al 3,5%.
3. Quando il ratto è sdraiato, cambiare il sistema in modo che il gas anestetico fluisca verso l'ogiva, che è fissata alla barra incisiva.
4. Togliete il ratto dalla camera della scatola e rasate l'area tra le orecchie e gli occhi; utilizzando un batuffolo di cotone imbevuto di Jodosept PVP, tamponate l'area rasata per rimuovere eventuali peli sciolti.
5. Posizionare il ratto nell'ogiva (Figura 1) e continuare l'anestesia con isoflurano 2,5% in O₂ (1 L/min). Controllare il livello di anestesia pizzicando l'area interdigitale. Se il ratto viene anestetizzato adeguatamente, i riflessi difensivi (cioè il ritiro del piede) vengono aboliti.
6. Monitora la respirazione e la risposta alla stimolazione durante la procedura e regola il vaporizzatore secondo necessità.
7. Applicare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia. Un sistema di riscaldamento controllato da feedback monitora e mantiene la temperatura corporea a 37 ± 0,5 °C.

2. Chirurgia

1. Mantenere il campo chirurgico sterile durante l'intero intervento chirurgico. Una volta che le mani del chirurgo e il campo operatorio sono sterili, muoviti solo con attenzione e ricordati di non rompere la sterilità. Ciò include la presenza di un campo sterile (ad esempio, teli impermeabili sterili) su cui è possibile appoggiare gli strumenti.
2. Iniettare 0,2 ml di mepivacaina per via sottocutanea al centro dell'area rasata. La mepivacaina è un anestetico locale che ha una durata d'azione fino a 3 ore. Anestetizzerà ulteriormente l'area chirurgica.
3. Con l'aiuto di un bisturi, praticare un'incisione sulla linea mediana che inizia tra le orecchie e si estende verso i 2 cm. Assicurarsi che anche il periostio (membrana lucida sotto la pelle) sia inciso. Esporre il teschio con quattro morsetti (Figura 2).
4. Utilizzando un batuffolo di cotone, rimuovere delicatamente il periostio fino a quando le suture coronali e sagittali non sono esposte; successivamente, tamponare il sangue con un batuffolo di cotone.
5. Determinare le coordinate del bregma utilizzando un ago fissato a un supporto della sonda, quindi contrassegnare la punta dell'ago con un pennarello nero. Utilizzando le viti di azionamento anteriore/posteriore (AP), della linea mediana/laterale (ML) e dorso-ventrale (DV), posizionare la punta dell'ago direttamente sopra il bregma.
6. Prendi le letture della scala dei noni AP e ML: sottrai 3,6 mm dalla lettura AP e 2,5 mm dalla lettura ML per l'impianto di elettrodi nell'STN destro, oppure aggiungi 2,5 mm per l'impianto di elettrodi nell'STN sinistro. Questa posizione sarà contrassegnata dalla tintura del pennarello dopo aver abbassato la punta dell'ago sulla superficie del cranio.
7. Fissare il trapano dentale sul grande supporto della sonda dello strumento stereotassico. Sposta il trapano dentale nell'area calcolata, cioè nel punto segnato sul cranio. Guardando attraverso il microscopio, praticare un foro (diametro circa 1 mm) attraverso il cranio fino a quando la dura madre non è visibile (il cranio ha uno spessore di circa 1 mm). Ritrarre la dura madre utilizzando una pinza per microdissezione o un ago sterile. La dura dura è abbastanza resistente da distruggere la punta dell'elettrodo.
8. Praticare un foro con il trapano dentale in ogni squama frontale e nello squama interparietale opposto al foro dell'elettrodo. Scollegare il portasonda dallo strumento stereotassico. Non perforare una sutura del cranio, poiché i vasi venosi seguono le suture sotto il cranio.
9. Avvitare una vite ossea in ciascuno dei cinque fori. Evitare di avvitare le viti troppo in profondità. Per le viti in acciaio inossidabile (M1.6), 2-3 giri della vite manterranno adeguatamente la vite senza esercitare pressione sul cervello. Il numero di giri dipenderà dal passo della vite. Clamp il supporto della sonda con l'elettrodo nel micromanipolatore (Figura 3).
10. Utilizzando le viti di azionamento AP, ML e DV, spostare il supporto della sonda con l'elettrodo fino a quando la punta non tocca quasi il bregma. Notare le letture delle scale a nonio AP, ML e DV al bregma. Quando vengono effettuate le letture, sollevare l'elettrodo di alcuni millimetri per evitare che l'elettrodo raschiasse il cranio durante il movimento. Per determinare le coordinate della posizione in cui l'elettrodo deve essere inserito nel foro, aggiungere 3,6 mm alla lettura AP e aggiungere (o sottrarre) 2,5 mm alla lettura ML.
11. Utilizzando le viti di azionamento AP e ML, spostare l'elettrodo nella posizione calcolata. A questo punto, la punta dell'elettrodo deve essere posizionata direttamente sopra il foro dell'elettrodo praticato. Quindi, guardando attraverso il microscopio, abbassare l'elettrodo al livello della dura madre (Figura 4). Questo livello funge da livello zero nella direzione DV. Successivamente, inserire delicatamente la punta dell'elettrodo nel cervello guardando attraverso il microscopio.
12. Collegare il pin dell'elettrodo al connettore del sistema di registrazione. Posizionare una gabbia di Faraday (o sostituirla con un foglio di alluminio) sopra il ratto nello strumento stereotassico (Figura 5). Mettere a terra lo strumento stereotassico con il contrappeso della stanza in cui si sta lavorando.
13. Avviare il sistema di registrazione. Se disponibile, utilizzare anche un altoparlante per ottenere un segnale acustico di scariche/salve di singole unità durante l'avanzamento dell'elettrodo.
14. Inserire lentamente l'elettrodo nel cervello registrando l'attività elettrica mentre si avanza l'elettrodo. A una profondità compresa tra 7,5 e 8,1 mm dalla dura, l'attività elettrica specifica dell'STN è solitamente rilevabile (Figura 6). L'attività tipica dei neuroni nell'STN è caratterizzata da un pattern di attivazione irregolare e da un'elevata velocità di attivazione (frequenza media: 40,9 ± 12,9 Hz).
15. Durante la registrazione, ridurre l'anestesia il più possibile (ad esempio, allo 0,8-1,0%); gli animali poco anestetizzati mostrano un'attività cerebrale elettrica più chiara.
16. Tamponare il sangue o il liquido cerebrospinale che è stato spostato dalla superficie del cranio quando l'elettrodo è stato abbassato.
17. Mescolare una piccola quantità di cemento dentale e applicarlo attorno all'elettrodo e intorno a quattro delle cinque viti usando una piccola spatola (Figura 7). La quinta vite verrà utilizzata per fissare il filo di terra della spina.
18. Scollegare il perno dell'elettrodo dal portaelettrodo e collegare il sistema di registrazione quando il cemento dentale è fissato.
19. Svitare la vite che non è stata fissata con il cemento dentale. Mettere la spina sul perno dell'elettrodo. Fissare il filo di terra della spina con la quinta vite (Figura 8).
20. Mescola il cemento dentale e applicalo intorno al tappo. Man mano che il cemento si addensa, modellalo attorno al tappo per formare un tappo. Evitare gli spigoli vivi del cemento dentale che potrebbero danneggiare l'animale e rimuoverli durante l'indurimento (Figura 9A e B).
21. Sbrigliare i bordi della ferita e chiuderli con una sutura nella parte anteriore e dietro il cappuccio. Quindi, disinfettare i bordi della ferita.
22. Collegare la spina della testa al filo fissato su una parte girevole. Rimuovere il ratto dallo strumento stereotassico.
23. Applicare tramadolo (12,5 mg/kg, per via intraperitoneale) al termine dell'intervento e poi una volta al giorno per 2-3 giorni. Posizionare il ratto in una gabbia pulita con supporto termico, fissare la girella su questa gabbia (Figura 10) e ispezionarla attentamente per 1 ora.
24. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale.

Risultati

Figura 1. Fissazione della testa nello strumento stereotassico. Il ratto è fissato dalle barre auricolari del telaio stereotassico, nonché dalla maschera per anestesia gassosa.

Figura 2. Esporre il cranio. Dopo un'inci...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Elettrodo Pt/Ir	FHC Inc.	Anno	Su misura: Specifica: UEPSEGSECN1M
Spine	GT Labortechnik (Arnstein/Germania)
Intestazione pin	DISTRELEC	Codice 143-95-324	datamate 1x3 a fila singola, 90°, tipo M80-8420342
presa	DISTRELEC	Codice 143-95-621	singola, palo diritto da 2 mm n. 1x3 datamate, tipo M80-8400342
Molla in acciaio inox	Plastiche ONE	SS0102	Parte-#: .120 X .156 ID molla (mm): 3.0 OD molla (mm): 4.0
Cemento dentale/Paladur	Heraeus Kulzer	64707938	Liquido, 500 ml
Cemento dentale/Paladur	Heraeus Kulzer	64707954	Polvere, rosa, 500g
Vite a testa	Hummer & Reiss	V2ADIN84 M1,6x3
Jodosept PVP	Vetoquinolo		435678/E04
Mepivacaina 1%	AstraZeneca		PZN03338515
epinefrina	Sanofi-Aventis		PZN00176118
Tramadolocloridrato	Rotexmedica		Codice: 38449.00.00

fila cilindrica