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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione dell'animale:
- Anestetizzare il ratto utilizzando un inalante (isoflurano) all'1-2% somministrato all'effetto o per iniezione (ketamina, xilazina, acepromazina). Il dosaggio dell'anestesia iniettabile è il seguente: 95,0 mg/kg di ketamina, 10,0 mg/kg di xilazina, 0,075 mg/kg di acepromazina.
nota: Utilizziamo con successo sia l'approccio anestetico inalante che quello iniettabile durante l'esecuzione di questo protocollo di registrazione CMAP, senza alcuna preferenza.
- L'animale deve essere mantenuto alla profondità anestesiologica appropriata prima dell'inizio dell'intervento, fino alla conclusione dell'intervento e fino a quando la buprenorfina post-operatoria non ha avuto effetto. Confermare la corretta anestesia con un breve pizzico di dita dei piedi per determinare che non viene suscitata una risposta di astinenza. Inoltre, testare il riflesso corneale con un batuffolo di cotone. Durante la procedura chirurgica, determinare che la frequenza cardiaca e la frequenza respiratoria non siano aumentate, il che suggerisce che la profondità dell'anestesia è diventata troppo leggera.
- Applicare un unguento veterinario sugli occhi dell'animale per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
- Il chirurgo deve lavarsi le mani con un disinfettante (scrub alla clorexidina) prima di iniziare l'intervento chirurgico. Il chirurgo deve indossare guanti sterili, una maschera facciale e un camice o un camice da laboratorio pulito. Tutti gli strumenti devono essere lavati e sterilizzati in autoclave prima dell'intervento chirurgico. Aggiungere una striscia indicatrice di sterilizzazione all'interno del kit di strumenti prima della sterilizzazione in autoclave a livello degli strumenti per verificare che la sterilizzazione sia completa. Il chirurgo deve verificare che l'intera linea sulla striscia sia nera prima di iniziare l'intervento chirurgico. Fissare con nastro adesivo anche l'esterno della scatola con del nastro adesivo per autoclave. Se l'intervento chirurgico deve essere eseguito su più animali nello stesso giorno, pulire gli strumenti tra un intervento chirurgico e l'altro e sterilizzarli in uno sterilizzatore a microsfere di vetro. Se necessario, sterilizzare entrambe le estremità dello strumento nello sterilizzatore a microsfere di vetro posizionando l'impugnatura dello strumento nello sterilizzatore per il tempo appropriato, rimuovendo lo strumento con un emostatico sterile, raffreddandolo in un campo sterile e quindi posizionando l'estremità funzionale dello strumento nello sterilizzatore a microsfere di vetro per il periodo appropriato.
- Una volta che l'animale è stato anestetizzato, posizionarlo sulla tavola chirurgica con la superficie dorsale rivolta verso il basso e l'addome rivolto verso l'alto in modo che il nastro possa essere utilizzato per fissare gli arti anteriori dell'animale alla tavola chirurgica.
- Radere la superficie ventrale caudalmente a partire dalla base del cranio e assicurarsi che l'area intorno all'addome su entrambi i lati della linea mediana sia rasata a seconda dell'emidiaframma che viene registrato. Applicare lo iodio povidone sulla superficie rasata della pelle.
2. Preparazione per le registrazioni CMAP:
- Dopo la preparazione dell'animale, posizionare l'elettrodo di terra per via sottocutanea nella coda (Figura 1).
- Posizionare l'elettrodo di riferimento per via sottocutanea nella regione addominale inferiore controlaterale.
- Posizionare il gel conduttivo sulla striscia di superficie autoadesiva o sull'elettrodo di registrazione del disco (dimensioni dell'elettrodo della striscia di superficie: 0,5 x 3 cm), quindi posizionare l'elettrodo di superficie trasversalmente lungo il margine costale unilaterale.
- Posizionare gli elettrodi stimolanti per via transcutanea a 0,5 cm di distanza l'uno dall'altro lateralmente alla trachea e superiormente alla clavicola. Inserire gli elettrodi a circa 1,0 cm di profondità attraverso la pelle. Fissare gli elettrodi a mano in modo che la loro posizione non si sposti con le successive stimolazioni.
nota: Elettrodi di stimolazione angolare di 90° rispetto alla pelle nel sito di inserimento.
3. Registrazioni del potenziale d'azione muscolare composto (CMAP):
- Ottenere registrazioni elettrofisiologiche utilizzando uno stimolatore/amplificatore seguite da analisi dei dati assistita da computer.
- I parametri di stimolo della stimolazione a trazione singola devono essere 0,5 msec, impulsi sopramassimali di 1,0 Hz. L'ampiezza dello stimolo deve essere compresa tra 6,0 e 8,0 V (Figura 2A).
nota: All'interno di un esperimento, utilizzare un'intensità di stimolo con la stessa ampiezza tra gli animali. L'obiettivo è massimizzare l'ampiezza della risposta utilizzando l'ampiezza minima della stimolazione. È importante notare che la risposta iniziale che si verifica al momento della stimolazione è un artefatto di stimolazione. Inoltre, è necessario prestare attenzione per ottenere una risposta CMAP preceduta da una linea di base stabile/piatta dopo l'artefatto di stimolazione, che è poi seguita dalla rapida risposta CMAP. Per ottenere tale risposta, può essere necessario riposizionare gli elettrodi di stimolazione e/o di registrazione.
- Attendere 30 secondi tra le stimolazioni e ripetere 10 stimolazioni di seguito per ottenere la risposta media (Figura 2B-C). Misurare l'ampiezza dalla linea di base al picco (Figura 2A). Condurre la stimolazione del nervo frenico durante la fase del ciclo respiratorio dell'animale quando il nervo frenico/diaframma non è attivato. La procedura può essere ripetuta sullo stesso animale per l'emidiaframma controlaterale.
- Dopo l'ultima sessione di registrazione CMAP, perfondere l'animale se verrà condotta la colorazione della giunzione neuromuscolare del diaframma (NMJ). Condurre registrazioni CMAP ripetutamente sullo stesso animale circa una volta alla settimana (o a intervalli a scelta).
- Dopo le registrazioni CMAP di sopravvivenza, consentire all'animale di riprendersi su un termoforo circolante ad acqua calda e monitorare continuamente durante il recupero fino a quando non è sveglio e sdraiato sternalmente. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico in compagnia di altri animali fino a quando non si è completamente ripreso.
- Una volta sdraiato sternalmente, monitorare l'animale ogni 12 ore per le prime 48 ore (successivamente una volta al giorno). Se l'animale sembra essere disidratato (pelle flaccida, svogliatezza), somministrare liquidi (soluzione di ringers lattati; per via sottocutanea; 1-2 ml per iniezione, con i siti ruotati; 2 volte al giorno) fino a quando il peso post-chirurgico e la perdita di liquidi non si stabilizzano. Fornire agli animali cibo ammorbidito in piccoli piatti durante il periodo post-operatorio acuto, se necessario, per incoraggiare il consumo se non riescono a raggiungere l'alimentatore del coperchio della barra metallica.
- Somministrare buprenorfina alla dose di 0,05 mg/kg prima della fine dell'intervento chirurgico e poi a intervalli di 12 ore per le prime 24 ore (e in base ai segni di dolore/stress successivi) tramite iniezione sottocutanea (sito ruotato). Se successivamente si notano segni di dolore o angoscia, trattare gli animali con buprenorfina. I segni indicativi di dolore/angoscia includono mancanza di attività, vocalizzazioni, mancanza di mangiare o bere (disidratazione), eccessiva perdita di peso, protezione, eccessivo rosicchiamento o graffio nel sito di incisione. Ulteriori criteri utilizzati per determinare il dolore e l'angoscia includono l'inrisposta a stimoli estranei, vocalizzazione transitoria o non provocata, respirazione affannosa o anormale, secrezione naso-oculare bruno-rossastra persistente, piloerezione marcata. Monitora anche le prove di scarsa igiene che farebbero pensare alla presenza di animali malati. Se si osserva che l'animale è ancora in difficoltà dopo 72 ore di trattamento (secondo i criteri di dolore/stress descritti sopra e dopo aver ricevuto il protocollo analgesico sopra descritto), sopprimere l'animale.
