in vivo Imaging del calcio utilizzando sensori di calcio localizzati sinapticamente in Drosophila melanogaster

Abstract

Fonte: Hancock, C. E. et al., Imaging ottico del calcio in vivo della plasticità sinaptica indotta dall'apprendimento in Drosophila melanogaster.J. Vis. Exp. (2019).

Questo video mostra un metodo per l'imaging del calcio in vivo utilizzando sensori di calcio localizzati sinapticamente nei moscerini. Descrive i passaggi per preparare i moscerini per la microscopia, condurre il condizionamento olfattivo e visualizzare l'afflusso di calcio indotto dagli odori.

Protocollo

1. Moscerini della frutta transgenici, Drosophila melanogaster

1. Incrociare mosche vergini e maschi femmine (allevate a 25 °C con 60% di umidità relativa su un ciclo luce/buio di 12 ore) che trasportano rispettivamente i costrutti Gal4 e UAS desiderati per produrre mosche in cui specifici neuroni di interesse esprimono un indicatore di calcio geneticamente codificato.
2. Invecchiare la progenie femminile dell'incrocio di cui sopra fino a quando non si trova nell'intervallo di 3-6 giorni dopo l'eclosione. Le mosche femmine sono preferibili a causa delle loro dimensioni leggermente più grandi.

2. Preparazione del moscerino della frutta per l'imaging del calcio in vivo

1. Seleziona una singola mosca femmina e anestetizzare sul ghiaccio per non più di 5 minuti.
2. Utilizzando una pinza fine, posizionare la mosca nella camera di imaging (illustrato nella Figura 1c). Assicurarsi che il torace e le zampe siano a contatto con i cavi elettrici nella parte inferiore della camera e che la testa sia piatta. Fissare la posizione della mosca utilizzando nastro adesivo trasparente.
   nota: Questo protocollo richiede una camera costruita su misura in cui le mosche sono fissate, con la capsula della testa accessibile per l'apertura e le mosche in grado di ricevere sia stimolazioni di odore alle antenne che scosse elettriche al torace e alle zampe (Figura 1).
3. Utilizzando una lama di bisturi chirurgico fissata al manico del bisturi (vedi Tabella dei materiali), tagliare una finestra nel nastro attorno alla testa della mosca, lasciando le antenne coperte e solo la parte più anteriore del torace esposta.
4. Circondare i lati e la parte posteriore della testa con colla indurente alla luce blu, accuratamente manipolata utilizzando uno spillo per insetti tenuto da mascelle concave-convesse. Fissare la colla utilizzando una lampada LED a luce blu.
5. Verificare che la colla sia completamente indurita e rimuovere eventuali residui di colla non indurita dalla superficie dorsale della testa della mosca.
6. Applicare una goccia della soluzione di Ringer (vedi Tabella dei materiali) per coprire la cuticola esposta della testa.
7. Usando un coltello da taglio a lama molto fine, taglia la cuticola. Per la rimozione più efficiente della cuticola, tagliare prima la parte posteriore della testa usando gli ocelli come punto di partenza. Quindi, tagliare ogni lato, medialmente agli occhi, per formare un lembo della cuticola che può essere facilmente strappato con una pinza.
8. Rimuovere la cuticola in eccesso che potrebbe ostruire la regione cerebrale di interesse.
9. Pulisci accuratamente la superficie dorsale di qualsiasi trachea usando una pinza fine, evitando la rottura del tessuto cerebrale stesso. Rimuovere e rinfrescare la soluzione di Ringer (vedere la Tabella dei materiali) secondo necessità per liberare l'area dai detriti di tessuto.
10. Posizionare l'ago per l'erogazione degli odori ipodermici in una posizione a circa 1 cm dalla testa della mosca. Assicurarsi che non ci sia nulla che possa ostruire l'erogazione degli odori alle antenne.
11. Al microscopio, collegare la camera di imaging al sistema di erogazione degli odori tramite l'ago ipodermico per l'erogazione degli odori.
12. Per consentire alla mosca di riprendersi completamente dall'anestesia e dall'intervento chirurgico e di adattarsi al flusso d'aria, implementare un periodo di riposo di 10 minuti in questa fase.

3. Imaging del calcio in vivo

1. Utilizzare un microscopio multifotone dotato di un laser a infrarossi e di un obiettivo a immersione in acqua (vedi Tabella dei materiali), installato su un tavolo isolato dalle vibrazioni. Per la visualizzazione di indicatori di calcio basati su proteine fluorescenti verdi (GFP), sintonizzare il laser su una lunghezza d'onda di eccitazione di 920 nm e installare un filtro passa-banda GFP.
2. Utilizzando la manopola di regolazione Z grossolana, eseguire la scansione attraverso l'asse Z del cervello e individuare la regione cerebrale di interesse. Utilizzare la funzione di ritaglio per concentrare la scansione solo su quest'area per ridurre al minimo il tempo di scansione e per ruotare la vista di scansione in modo che la parte anteriore della testa sia rivolta verso il basso.
3. Regola le dimensioni del fotogramma a 512 x 512 px, la velocità di scansione a > 4 Hz e la scansione della regione (nella dimensione Y) in modo da coprire i neuroni di interesse.

4. Visualizzazione dei transitori di calcio evocati dagli odori attraverso il condizionamento olfattivo

1. Utilizza un sistema di erogazione degli odori in grado di fornire diversi stimoli olfattivi in modo temporalmente preciso.
   1. Utilizzare un computer aggiuntivo per controllare il dispositivo e per comunicare con il software del microscopio di imaging per coordinare le stimolazioni degli odori con l'acquisizione delle immagini durante gli esperimenti.
   2. Avviare un pacchetto macro pre-programmato in grado di collegare il software di acquisizione delle immagini e il programma di erogazione degli odori (ad esempio, un pacchetto macro VBA installato nel software di controllo del microscopio, vedere Tabella dei materiali) che risponde a un trigger di input esterno fornito dall'avvio di un protocollo di erogazione degli odori in un programma separato).
2. Avvia la misurazione monitorando i transitori di calcio evocati dagli odori "pre-allenamento"/naive a una risoluzione di 512 x 512 px e un frame rate di 4 Hz. Fornisci uno stimolo olfattivo di 2,5 s affiancato da un'acquisizione di immagini aggiuntiva per 6,25 s prima dell'insorgenza dell'odore (per stabilire un valore basale F₀) e 12,5 s dopo l'offset dell'odore. Ripeti l'operazione con un secondo odorante e poi con un terzo odorante.
3. Continuare 3 minuti dopo questa misurazione con il condizionamento classico ("allenamento") della mosca.
   1. Seleziona uno degli odori presentati nella fase di "pre-allenamento" per diventare l'odore di stimolo condizionato (CS⁺) e un altro per diventare l'odore CS^-. Presenta l'odore CS⁺ utilizzando il sistema di erogazione degli odori controllato da computer per 60 s insieme a dodici scosse elettriche da 90 V.
   2. Dopo una pausa di 60 s, presentare l'odore CS^- da solo per 60 s. Utilizzare come odoranti 4-metilcicloesanolo e 3-ottanolo. Non presentare il terzo odorante (ad es. 1-ottano-3-olo) durante questo allenamento poiché viene utilizzato come controllo solo prima (passaggio 4.2.) e dopo (passaggio 4.4) la fase di addestramento.
4. Misurare nuovamente i transitori di calcio evocati dagli odori "post-allenamento" ripetendo il protocollo di stimolazione degli odori "pre-allenamento" (passaggio 4.2.) 3 minuti dopo aver terminato la fase di allenamento (passaggio 4.3).
   nota: La tempistica di questo passaggio dovrebbe riflettere il tempo di interesse dopo la formazione della memoria (ad esempio, eseguire questo passaggio 3-4 minuti dopo la fase di condizionamento per indagare la memoria a breve termine). In genere, le mosche possono sopravvivere per diverse ore in questa preparazione.
5. Salvare i file di imaging in un formato appropriato (ad es. Tiff) per una successiva analisi dell'immagine.

5. Analisi delle immagini

1. Per analizzare le immagini, apri i file Tiff (o simili) nel software di analisi delle immagini come Fiji.
2. Allinea le pile utilizzando un algoritmo di correzione del movimento per garantire un movimento minimo nelle direzioni X e Y. Scartare tutte le registrazioni che mostrano un forte movimento sull'asse Z.
3. Selezionare lo strumento software utilizzato per contrassegnare una regione di interesse (ROI) intorno all'area da esaminare. Questo dovrebbe essere il più preciso possibile per limitare l'influenza della fluorescenza di fondo.
4. Utilizzare il rispettivo strumento software per estrarre i dati sull'intensità della fluorescenza temporale come file di dati dal ROI selezionato, in modo tale da generare un valore per ogni fotogramma della registrazione.
5. Aprire i dati utilizzando un programma di analisi dei dati per calcolare i valori ΔF/F₀ per ogni traccia di odore. F₀ = fluorescenza media nei 2 s prima dell'insorgenza dell'odore. ΔF = la differenza tra la fluorescenza grezza in un dato fotogramma e F₀. Da questi valori, calcolare un valore ΔF/F₀ per ogni fotogramma, che può essere tracciato nel tempo per riflettere la fluorescenza relativa durante il periodo di stimolo dell'odore.

Risultati

Figura 1: Costruzione di una camera di montaggio e preparazione di una mosca per l'imaging.(a) Fasi per la costruzione della camera di montaggio delle mosche. La base è formata da un vetrino da microscopio standard (1) ricoperto da una sottile rete di plastica (2). Due fili elettrici che trasportano cariche opposte (3) sono incollati alla slitta su entrambi i lati. I fili vengono spe...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1-ottano-3-olo	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti	O5284	Sostanza chimica usata come odorizzante
3-ottanolo	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti	218405	Sostanza chimica usata come odorizzante
4-metilcicloesanolo	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti	153095	Sostanza chimica usata come odorizzante
Filtro passa-banda per EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germania
Nastro adesivo trasparente	Tesa SE, Norderstedt, Germania		Nastro adesivo trasparente standard
Ganasce concave-convesse	Strumenti per la scienza, North Vancouver, Canada	Codice 10053-09	Portalame con ganasce concave-convesse
Pinze fini	Strumenti per la scienza, North Vancouver, Canada	Codice: 11412-11	Pinze con punta 0,1 x 0,06 mm
Ago ipodermico	Sterican - B. Braun, Melsungenk, Germania	4665120	1,20x40 millimetri
Spille minuziose per insetti	Strumenti per la scienza, North Vancouver, Canada	Codice 26002-10	Diametro 0,1 mm, punta 0,0125 mm
Flusso di acqua	Forniture dentali Kent Express, Gillingham, Regno Unito	953683	Colla fotopolimerizzabile blu
Vetrino per microscopio	Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germania	656,1	Slitta obiettivo standard 76 x 26 mm
olio minerale	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti	Codice: M8410	Utilizzato come diluente per odorizzanti
Laser Ti-Sapphire con blocco della modalità Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, Stati Uniti		Laser a femtosecondi a infrarossi sintonizzabili
Microscopio multifotone LSM 7MP dotato di rivelatori BiG	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germania		Microscopio multifotone, più aziende forniscono dispositivi simili.
Obiettivo ad immersione in acqua Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germania	Numero 421452-9900-000	Obiettivo W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
La soluzione di Ringer	n.d.	n.d.	5 mM di KCl, 130 mM di NaCl, 2 mM di MgCl2, 2 mM di CaCl2, 5 mM di Hepes-NaOH, 36 mM di saccarosio, pH = 7,4
Coltello da pugnalata	Sharpoint, Società di specialità chirurgiche, Reading, PA, Stati Uniti	72-1551	5,0 mm Profondità della lama diritta limitata
Lama per bisturi chirurgico	Swann-Morton, Sheffield, Regno Unito	303	N. prodotto: 11
Manico per bisturi chirurgico	Swann-Morton, Sheffield, Regno Unito	907	N. prodotto 7S/S
Software VBA (Visual Basics of Applicatons) per ricevere un trigger dal dispositivo di erogazione degli odori e dal dispositivo di applicazione della scossa elettrica (alimentatore) per interagire con il software ZEN di Zeiss che controlla il microscopio.	Scritto su misura e disponibile su richiesta	n.d.	n.d.