Neuromodulazione indotta da ultrasuoni utilizzando un sistema di array di microelettrodi

Abstract

Fonte: Liang, R. et al., Neuromodulazione a ultrasuoni focalizzata di colture neurali umane in vitro in array di microelettrodi multi-pozzetto. J. Vis. Exp. (2024)

Questo video dimostra il metodo per indurre la modulazione dell'attività neurale in neuroni umani derivati da iPSC in coltura in un array di microelettrodi multi-pozzetto, o sistema MEA, utilizzando un trasduttore a ultrasuoni focalizzato.

Protocol

1. Preparazione dei materiali

1. Aspirare il terreno di coltura e utilizzarlo per riempire un singolo pozzetto in una piastra di coltura per neuroni a 24 pozzetti con un array di microelettrodi (MEA) incorporato (Figura 1A).
2. Sterilizzare l'interfaccia parafilm, l'elastico e il cono a ultrasuoni focalizzati (FUS) con la sua membrana di gomma utilizzando etanolo al 70% per 10 minuti e posizionarli nella cappa aspirante per il successivo assemblaggio.
3. Degassare 300 mL di acqua deionizzata e 50 mL di gel di accoppiamento. Centrifugare l'acqua e il gel a 160 x g per 5 minuti per evitare di indurre cavitazione all'interno del mezzo di accoppiamento.
   nota: La fonte originale delle cellule staminali pluripotenti indotte umane (HiPSC) proviene da linee cellulari GM01582 e CIPS. In media, è possibile raggiungere una densità di 5 x 10⁴ motoneuroni e 2,5 x 10⁴ astrociti per pozzetto.

2. Connessione e configurazione delle periferiche

1. Fissare il cono FUS al trasduttore utilizzando le viti e sigillare il cono con una membrana di gomma flessibile in una cappa sterile ventilata. Riempire il cono con l'acqua degassata e deionizzata (DG-DI) del passaggio 1.3 e assicurarsi dell'assenza di bolle nel cono per evitare la cavitazione.
2. Utilizzare un'asta filettata personalizzata per fissare il supporto stampato in 3D a un telaio (Figura 1B). Posizionare il telaio in modo che la testa del trasduttore FUS si trovi sopra il pozzetto che verrà stimolato.
3. Utilizzare un elastico per fissare il parafilm sopra il pozzetto sulla piastra MEA a 24 pozzetti contenente il mezzo e gli HiPSC.
4. Preparare il sistema FUS collegando l'elettronica del driver back-end del trasduttore a ultrasuoni, in questo caso l'uscita di potenza del trasduttore (TPO), a una presa di corrente da 100-240 V e collegando la rete corrispondente al TPO e al trasduttore FUS. La rete di adattamento garantisce un efficiente accoppiamento elettrico tra il trasduttore e il TPO.
5. Collegare il sistema MEA a una presa di corrente (100-240 V) (Figura 2B, Collegamento 5). Collegare la porta di sincronizzazione del sistema MEA al TPO (Figura 2B, Connessione 3). Questa connessione sincronizzerà l'acquisizione dei dati da parte del sistema MEA con la stimolazione FUS.
6. Posizionare la piastra MEA a 24 pozzetti nel sistema MEA e rimuovere il coperchio per consentire il contatto diretto tra il trasduttore e il pozzetto. Posizionare il trasduttore a 5-10 mm sopra la piastra del pozzetto per lasciare spazio al gel di accoppiamento degassato, come descritto al punto 3.2 (Figura 2A e Figura 1B).

3. Stimolazione e acquisizione del segnale neuronale

1. Impostare i parametri FUS sul pannello di controllo TPO (Tabella 1).
2. Applicare il gel di accoppiamento sulla parte superiore del parafilm e abbassare il trasduttore FUS nel gel di accoppiamento, assicurando il contatto con il gel con bolle d'aria minime (Figura 1A).
3. Avviare la registrazione del sistema MEA facendo clic sul pulsante Start nell'interfaccia utente.
4. Avviare la sonicazione FUS premendo il pulsante in basso a destra sul TPO (Figura 2A, Etichetta 7) e attendere almeno 5 minuti tra ogni ciclo di sonicazione per consentire ai neuroni di tornare a uno stato di base.
5. Utilizzare l'impulso di trigger generato dal sistema FUS per allineare la sequenza di stimolazione FUS alla registrazione MEA (Figura 1B, Connessione 3).

Tabella 1: Parametri degli ultrasuoni focalizzati (FUS) impostati sul TPO

parametro	valore
Potenza massima/canale	1.200 W
Fatto	0,749 W/canale
ISPPA	10,79 W/cm2
ISPTA	0,05 W/cm2
Lunghezza burst	0,100 ms
frequenza	250,00 kHz
fuoco	39.800 millimetri
periodo	20.000 metri quadrati
temporizzatore	60.000 secondi

Results

Figura 1: Neuromodulazione FUS con un array di microelettrodi multipozzetto (MEA). (A) Schema della configurazione per la neuromodulazione FUS con un MEA multi-pozzetto. Le onde acustiche generate dal trasduttore FUS si propagano attraverso un cono FUS riempito con acqua degassata e vengono accoppiate utilizzando gel ad ultrasuoni. Il parafilm è fissato al pozzetto utilizzando un ela...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema MEA	Axion Biosystem Inc.	Maestro Edge	Frequenza di campionamento: 11500 Hz
Piastra MEA	Axion Biosystem Inc.	CytoView MEA	Elettrodo e pozzetto: 16 elettrodi in 24 pozzetti
Interfaccia piastra a pozzetti	Amcor Inc.	Parafilm PM996; P7793	Spessore: 127 μm
Serbatoio e regolatore di CO2 per la coltura	AirGas Inc./ Harris Inc.	9296NC	Concentrazione: 5%
Terreni di coltura	ThermoFisher Inc.	Laminina; 23017-015	Concentrazione: 1 μg/mL
Neuroni HiPSC	Peprotech	CIPS e GM01582 derivati; 450-10	Concentrazione: 10 ng/mL (Fare riferimento a Taga et al [2021]13)
trasduttore	Concetti sonici Inc.	CTX250; 008	Frequenza centrale: 250 kHz
Rete di corrispondenza	Concetti sonici Inc.	CTX250; NFS102v2	Impedenza: 50 Ω
Potenza di uscita del trasduttore (TPO)	Concetti sonici Inc.	Versione 4.1; 020	Frequenza: da 250 kHz a 2,5 MHz
membrana	McMaster Inc.	Gomma siliconica; 5542N115	Spessore: 0,0127 cm
Gel di accoppiamento	Laboratorio Parker, Inc.	Acquasonico 100; B08DDWG GXB	Viscosità: 130.000-185.000 cops
Collegamento al supporto della sonda	McMaster Inc.	Rubare Barra Filettata; 90322A661	Lunghezza: 1–1/2" di lunghezza
idrofono	Concetti sonici Inc.	Y-104; 009	Intervallo: 50 kHz–1,9 MHz
Serbatoio dell'acqua	Concetti sonici Inc.	Wt	Dimensioni: 30 cm x 30 cm x 30 cm
Unità di condizionamento dell'acqua	Concetti sonici Inc.	WCU; Codice: SN006	Velocità del flusso: 50 mL/s massimo
oscilloscopio	Rohde-Schwarz Inc.	RTC1002	Frequenza di campionamento: fino a 50 MHz
Palco	Concetti sonici Inc.	MicroStage; 2	Precisione: 1 μm
Foglio termocromico	TIPTEMP Inc.	Foglio a cristalli liquidi; TLCSEN337	Intervallo: 22–24 °C
computer	Microsoft Surface	Surface Pro	CPU i5 1035G4: 3,7 GHz
Software per il trasferimento dei dati	Mathworks Inc.	MATLAB	Versione 2021b
Software di elaborazione	Fondazione del software Python	pitone	Versione 3.7.10