1. Configurazione prima delle registrazioni
- Preparare le soluzioni di registrazione con le concentrazioni di ioni come indicato nella Tabella 1.
- Preparare 15 mL di soluzioni madre 2 M in acqua ultrapura per MgCl2, CaCl2, KCl e CsCl.
- Pesare i componenti solidi per 100 mL di soluzioni tamponate intracellulari e 500 mL di soluzioni tamponate extracellulari secondo la Tabella 1 in becher separati e successivamente aggiungere la rispettiva quantità delle soluzioni madre preparate. Ad esempio, per il tampone intracellulare, utilizzare 0,3803 g (10 mM) di EGTA (acido etilenglicole tetraacetico), 0,2383 g (10 mM) di HEPES (acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico) e 0,6428 g (110 mM) di NaCl e aggiungere 100 μL delle soluzioni madre 2 M MgCl2 e CaCl2 e 50 μL delle soluzioni madre 2 M KCl e CsCl.
- Aggiungere acqua ultrapura e regolare attentamente il pH utilizzando acidi e basi, che non interferiscono con la misurazione, cioè non sono condotti dal ChR (canalrodopsine), come l'acido citrico e la N-metil-D-glucamina (NMG+).
- Regolare l'osmolarità a 290 mOsm per le soluzioni intracellulari e a 320 mOsm per le soluzioni extracellulari con glucosio.
nota: Le soluzioni intracellulari leggermente ipoosmotiche aumentano il tasso di successo del patching.
- Filtra sterile tutte le soluzioni attraverso filtri da 0,22 μm. Conservare le soluzioni a 4 °C per due settimane o congelarle a -20 °C per una conservazione a lungo termine.
- Calcola i potenziali di giunzione del liquido e prepara i protocolli di registrazione.
NOTA: La variazione della concentrazione extracellulare di cloruro dopo aver stabilito la configurazione dell'intera cellula provoca un significativo potenziale di giunzione liquida (LJP) che deve essere corretto. Gli LJP possono essere misurati o calcolati direttamente, qui viene utilizzata quest'ultima opzione. In questo protocollo, verrà utilizzata la correzione online, che richiede un protocollo di registrazione per ogni buffer esterno. Tuttavia, per un insieme più ampio di soluzioni esterne, si consiglia una post-correzione di LJP per evitare false correzioni.
- Apri il calcolatore del potenziale di giunzione (JPC) e apri la finestra di dialogo "Nuovo esperimento". Quindi selezionare "Misure di patch-clamp". Selezionare "Misure su cella intera" e "Elettrodo standard in soluzione salina" e inserire una temperatura di 25 °C. Tra un passaggio e l'altro, procedere accettando la selezione premendo il pulsante "Avanti".
NOTA: Gli esperimenti vengono eseguiti a una temperatura ambiente di 25 °C in un laboratorio climatizzato. Assicurarsi che le soluzioni tampone abbiano una temperatura ambiente prima di iniziare gli esperimenti. Per variare la temperatura del campione è possibile utilizzare uno stadio di incubazione o una camera. La temperatura del bagno può essere misurata frequentemente con un termometro.
- Aggiungere tutte le concentrazioni individuali di anioni e cationi della soluzione pipettata e del tampone ad alto contenuto di cloruro secondo le concentrazioni elencate nella Tabella 1.
nota: Il JPC calcolerà un LJP di -0,5 mV per le condizioni di avviamento.
- Fare clic su "Nuova soluzione per il bagno" per inserire la composizione anionica e cationica del tampone a basso contenuto di cloruro.
nota: Il JPC calcolerà ora un nuovo LJP di +12,6 mV in base alla soluzione di registrazione extracellulare modificata.
- Preparare due protocolli corretti per LJP per le due condizioni di misura sottraendo il LJP calcolato dal potenziale di mantenimento applicato; -0,5 mV per le soluzioni esterne ad alto contenuto di cloruro e +12,6 mV per quelle a basso contenuto di cloruro. Quindi i protocolli iniziano con -79,5 mV (alto cloruro) e -92,6 mV (basso cloruro), rispettivamente per ottenere un potenziale di mantenimento iniziale corretto per LJP di -80 mV in entrambi i casi><.
nota: I seguenti passaggi si applicano al software di acquisizione dati menzionato nell'elenco dei materiali.
- Aprire l'editor di protocollo nel software di acquisizione. Dal menu "Modalità", seleziona "Stimolazione episodica" e includi 7 sweep.
- Passa al menu "Forma d'onda" nell'editor e includi un periodo di 200 ms con potenziale di mantenimento di 0 mV seguito da un periodo di 2 s con potenziale di mantenimento variabile a partire da -79,5 mV per cloruro alto. Includere un "livello delta" di 20 mV per il secondo periodo per aumentare il potenziale di mantenimento di 20 mV in ogni scansione.
- All'interno degli step di tensione dell'editor di forme d'onda, applicare un periodo di illuminazione di 500 ms con luce a 540 nm (3,10 mW/mm²). A tale scopo, modificare il "modello di bit digitale" dell'otturatore collegato che controlla la sorgente luminosa in modo che sia attivo 500 ms dopo il secondo periodo sopra descritto (vedi 1.2.6).
nota: L'intensità della luce può influenzare le proprietà biofisiche delle correnti dei canali come l'ampiezza o l'inattivazione. Pertanto, le densità di potenza della luce dovrebbero essere sempre segnalate. Per misurare la potenza luminosa dopo aver attraversato tutte le ottiche e il vetrino coprioggetti, utilizzare un optometro calibrato. Per calcolare la densità di potenza, determinare il campo illuminato dell'obiettivo con un micrometro per oggetti e dividere la potenza luminosa misurata per il campo illuminato determinato.
- Conservare il protocollo per la soluzione extracellulare ad alto contenuto di cloruro. Modificare il protocollo e sostituire il potenziale di mantenimento del primo livello di -92,6 mV (basso cloruro esterno). Salvare questo secondo protocollo per misurare la condizione extracellulare a basso contenuto di cloruro.
- Rivestimento in lisina di vetrini coprioggetti come da protocollo adattato.
- Mettere diversi vetrini coprioggetti da 100 in una capsula di Petri di vetro e aggiungere 250 ml di HCl (1 N).
- Posizionare la capsula di Petri con i vetrini coprioggetti su uno shaker lineare. Agitare a 120 giri/min per 72 ore per pulire i vetrini coprioggetti e, successivamente, risciacquare con acqua ultrapura per neutralizzare il pH.
- Immergerli in un piccolo volume di etanolo al 95% per un'ulteriore pulizia.
NOTA: I vetrini coprioggetto puliti possono essere conservati in etanolo al 70% prima di procedere. Lavorare sotto una cappa a flusso laminare per i passaggi successivi.
- Usando un bruciatore Bunsen e una pinzetta, fiamma ogni vetrino coprioggetto e trasferiscilo in una nuova capsula di Petri.
- Incubare i vetrini coprioggetti con una soluzione sterile di poli-D-lisina da 50 μg/mL per almeno 1 ora (o durante la notte) a temperatura ambiente, agitando con un agitatore lineare a 150 giri/min.
- Lavare i vetrini coprioggetti con acqua ultrapura per rimuovere la poli-D-lisina in eccesso.
- Stendere i vetrini coprioggetto su carta sterile ad asciugare per 10 minuti ed esporli alla luce UV (ultravioletta) per la sterilizzazione (almeno 20 minuti).
- Raccogliere i vetrini coprioggetti in una capsula di Petri sterile ricoperta da un foglio di alluminio fino al momento dell'uso.
- Preparare il DNA del gene PsACR1 fuso con mCherry utilizzando tecniche standard di biologia molecolare.
- Clonare la sequenza genica umana ottimizzata per il codone che codifica per PsACR1 in un plasmide peGFP-C1 (promotore CMV (citomegalovirus), resistenza alla kanamicina) in frame con il fluoroforo mCherry utilizzando enzimi di restrizione o altri metodi di clonazione consolidati.
Nota: è possibile utilizzare anche altri fluorofori, ma assicurarsi di avere a disposizione i set di filtri corrispondenti per osservare la loro fluorescenza al microscopio nella configurazione.
- Trasformare il DNA plasmidico in cellule chemiocompetenti di E. coli XL1Blue tramite shock termico come da protocollo standard e piastrelarle su piastre di agar (30 μg/mL di kanamicina). Far crescere i batteri placcati durante la notte a 37 °C.
- Il giorno successivo, inoculare 4 mL di brodo di lisogenia integrato con 30 μg/mL di kanamicina con cellule di singole colonie e incubarle per una notte a 37 °C e 180 giri/min in un incubatore.
- Dopo l'incubazione notturna, purificare il DNA plasmidico dalle colture utilizzando un kit disponibile in commercio secondo le istruzioni del produttore.
- Semina le cellule
NOTA: Eseguire i passaggi sotto una cappa a flusso laminare.
- Posizionare fino a tre vetrini coprioggetti rivestiti di lisina uno accanto all'altro in una capsula di Petri da 35 mm.
nota: Premerli delicatamente contro il fondo del piatto per evitare che scivolino l'uno sull'altro.
- Seminare 1,5 x 105 cellule HEK (cellule renali embrionali umane) in 2 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) standard integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) in ogni piatto.
- Integrare all-trans retinal alla concentrazione finale di 1 μM. Far crescere le cellule per almeno un giorno prima di procedere con il passaggio 1.6.
- Trasfetta transitoriamente le cellule tramite lipofezione.
- Per ogni piatto di cellule, preparare una soluzione di 2 μg di DNA plasmidico (acido desossiribonucleico) in 250 μL di DMEM senza FBS e 6 μL di reagente di trasfezione.
- Dopo 15 minuti di incubazione, aggiungere delicatamente (goccia a goccia) la soluzione alle cellule.
- Preparare i ponti di agar
- Aggiungere 0,75 g di agarosio a 50 ml di soluzione sterile di cloruro di sodio (140 mM) e scioglierla riscaldandola in un forno a microonde.
NOTA: 2 - 3 M KCl per la preparazione del ponte di agar riducono ulteriormente la LJP a causa della maggiore concentrazione (ad es. diffusione costante dal ponte) e dell'uguale mobilità degli ioni K+ e Cl-, ma è stato evitato per ridurre al minimo la perdita di ioni (in particolare Cl-) nella soluzione del bagno.
- Riempire i puntali per pipette da 10 μl (o un tubo di piccolo diametro) con la soluzione liquida di agarosio utilizzando una siringa.
nota: Evitare bolle d'aria nel ponte.
- Dopo che i ponti di agar sono stati raffreddati e solidificati, conservarli in una soluzione sterile di cloruro di sodio da 140 mM.
- Preparare gli elettrodi di registrazione e da bagno.
- Rimuovere i fili d'argento dal bagno e dall'elettrodo di registrazione della configurazione patch-clamp.
- Lucidare i fili con carta vetrata per rimuovere il cloruro d'argento da esperimenti precedenti. Immergere il filo d'argento pulito in 3 M KCl e collegarlo al polo positivo di una batteria da 1,5 V per il rivestimento elettrolitico con cloruro d'argento.
NOTA: È possibile utilizzare un alimentatore da laboratorio al posto di una batteria.
- Estrarre le pipette patch a bassa resistenza (1,5-3,0 MΩ) dai capillari di vetro con un estrattore per micropipette e lucidarle a fuoco. Conservare le pipette al riparo dalla polvere per il giorno della misurazione.
- Accendere tutti i componenti della configurazione per riscaldarli alla temperatura di lavoro 30 minuti prima delle registrazioni. Assicurarsi che i tamponi siano a temperatura ambiente.
2. Misure di selettività
- Avviare le registrazioni da 24 a 48 ore dopo la trasfezione transitoria delle cellule.
- Posizionare un vetrino coprioggetti nella camera di misura e sigillarlo con silicone per evitare perdite dal tampone esterno. Conserva la capsula di Petri con gli altri vetrini coprioggetti in un'incubatrice per la prossima serie di esperimenti.
- Riempire con cura la camera con tampone extracellulare (alto [Cl-]) per evitare il distacco delle cellule, quindi posizionarla al microscopio e utilizzare l'obiettivo 40X per visualizzare le cellule.
- Posizionare un ponte agar sull'elettrodo del bagno e posizionarlo nella camera insieme al sensore di livello del fluido e all'uscita di perfusione del gestore del bagno.
- Scambiare due volte la soluzione extracellulare con 1 mL di soluzione esterna fresca (Cl--) per rimuovere il terreno di coltura residuo e le cellule staccate.
- Metti a fuoco le cellule e cerca una cellula trasfettata (fluorescente), che deve essere isolata dalle altre cellule. Utilizzare un set di filtri a tripla banda e una luce arancione (590 nm; larghezza di banda 15 nm; 100% di intensità) per eccitare e visualizzare mCherry.
nota: Le celle HEK possono essere accoppiate elettricamente alle loro vicine mediante giunzioni gap con conseguente bassa resistenza della membrana nella configurazione a cella intera.
- Riempire una delle pipette estratte con la soluzione intracellulare e rimuovere le bolle d'aria capovolgendo la pipetta più volte.
- Montare la pipetta sul portapipetta e applicare una certa pressione positiva per evitare l'intasamento del puntale.
- Individuare la punta della pipetta per cerotti sotto il microscopio e spostarla vicino alla cellula utilizzando il micromanipolatore.
nota: I seguenti passaggi si applicano all'amplificatore, al software di acquisizione dati e di valutazione menzionati nell'elenco dei materiali.
- Avviare il "test della membrana" nel software di acquisizione dati e applicare un passo di tensione (impulso di prova; ad es. 5 mV per 10 ms, basale a 0 mV), manualmente o automaticamente tramite il software specificato utilizzando la "modalità bagno" durante l'esecuzione del "test della membrana" nel software di acquisizione dati.
- Verificare che la resistenza della pipetta sia nell'intervallo desiderato (1,5-3,0 MΩ).
- Zero correnti di offset regolando il potenziale della pipetta ruotando la manopola di offset della pipetta sull'amplificatore mentre si lavora in "modalità bagno" del "test della membrana".
- Stabilire una patch nella configurazione a cella intera.
NOTA: I passaggi seguenti richiedono l'applicazione di una pressione positiva e negativa erogata alla porta laterale del supporto per pipette usato. Questo può essere fatto utilizzando una siringa, tramite un boccaglio o un regolatore di pressione a controllo elettronico. In questo protocollo, la pressione positiva e negativa viene applicata tramite un boccaglio.
- Avvicinarsi lentamente alla cella con la pipetta per cerotti dall'alto e scaricare la pressione positiva subito prima di toccarla.
NOTA: Quando la punta è vicina alla cella, la resistenza aumenterà leggermente; Ciò è indicato da una dimensione ridotta dell'impulso di prova.
- Cambiare il "test di membrana" da "modalità bagno" a "modalità patch", quindi il potenziale di mantenimento al potenziale di riposo previsto delle celle (da -30 a -40 mV).
- In alcuni casi, la configurazione attaccata alla cella si forma dopo il rilascio della pressione positiva. In caso contrario, applicare delicatamente una pressione negativa per favorire la formazione di gigaseal.
nota: La configurazione collegata alla cella si stabilisce quando l'impulso di prova viene ridotto a due piccoli picchi capacitivi all'inizio e alla fine dell'impulso e la resistenza della membrana è nell'intervallo GΩ; tensioni negative fino a -60 mV possono facilitare la formazione di gigaseal.
- Compensare la capacità della pipetta ruotando le manopole "compensazione della capacità della pipetta" per ottenere una risposta piatta dell'impulso di prova.
- Rompere il cerotto senza distruggere il sigillo applicando brevi impulsi di pressione negativa o pressione negativa con forza crescente, per ottenere la conformazione dell'intera cellula><.
nota: Il successo della transizione dalla configurazione a celle collegate a celle intere è indicata da un aumento dei picchi capacitivi.
- Applicare la compensazione della resistenza in serie impostando i parametri dell'intera cella e le regolazioni di compensazione dell'amplificatore utilizzato per un bloccaggio accurato del potenziale della membrana alla tensione di mantenimento desiderata.
- Passare dal "test della membrana" alla modalità "cella intera", nel pannello "Compensazione resistenza in serie" attivare la "previsione" e la "correzione" fino al 90% evitando overshot e oscillazioni della risposta capacitiva, accendere l'interruttore di compensazione dell'intera cella e regolare i parametri dell'intera cella con le apposite manopole del pannello frontale ("capacità dell'intera cella" e "resistenza in serie") dell'amplificatore in modo iterativo per ottenere un Risposta piatta della guarnizione di prova.
nota: Per una descrizione dettagliata della compensazione e della correzione della resistenza in serie, fare riferimento al manuale dell'amplificatore o alle linee guida, poiché questa procedura varia tra i diversi produttori.
- Dopo aver stabilito la configurazione dell'intera cellula, attendere almeno 2 minuti prima di registrare per garantire una sostituzione sufficiente della soluzione intracellulare attraverso la pipetta del cerotto.
- Registrare le correnti indotte dalla luce a diversi potenziali di mantenimento utilizzando i protocolli che sono stati impostati in precedenza (in 1.2).
- Sostituire il tampone extracellulare a basso [Cl-] nella camera almeno cinque volte senza distruggere il cerotto e registrare un'altra relazione corrente-tensione (cfr. punto 1.2) alla nuova concentrazione di cloruro.
nota: Un sistema di perfusione per lo scambio automatico del tampone facilita questo processo, ma non è necessario.
- Ripetere il punto 2.15 per ogni condizione ionica da testare, ma controllare ripetutamente la qualità del cerotto tra le misurazioni con un "test di membrana" descritto sopra.
nota: Per garantire una tensione di membrana accurata e una composizione ionica intracellulare stabile, la resistenza di membrana deve essere superiore a 500 MΩ, mentre la resistenza di accesso non deve superare i 10 MΩ, vedi 2.12.6). Non dimenticare di disattivare la compensazione dei parametri dell'intera cella per il test della membrana.
- Ripetere da 2.2. a 2.15. per diverse cellule, ma prendere un nuovo vetrino coprioggetto per ogni serie di test per garantire la salubrità delle cellule.
Tabella 1: Composizione ionica delle soluzioni tamponate. Composizione di tamponi intracellulari (intra.) ed extracellulari (extra.) per esperimenti di selettività del cloruro in cellule HEK. Abbreviazioni utilizzate: acido etilenglicole tetraacetico (EGTA), acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico (HEPES) e aspartato (ASP). Tutte le concentrazioni sono in mM.
| intra. | extra.1 | extra.2 |
| ad alto contenuto di cloruro | a basso contenuto di cloruro | a basso contenuto di cloruro |
| c [mM] | c [mM] | c [mM] |
| Na-ASP | 0 | 0 | 140 |
| NaCl | 110 | 140 | 0 |
| Kcl | 1 | 1 | 1 |
| CsCl | 1 | 1 | 1 |
| CaCl2 | numero arabo | numero arabo | numero arabo |
| MgCl2 | numero arabo | numero arabo | numero arabo |
| HEPES | 10 | 10 | 10 |
| EGTA | 10 | 0 | 0 |
| ph | 7.2 | 7.2 | 7.2 |
| osmolarità | 290 mOsm | 320 mOsm | 320 mOsm |