Registrazioni perforate Patch-Clamp dei corpi cellulari dei neuroni sensoriali dell'orecchio interno

Abstract

Fonte: Iyer, M. R., et al. Isolamento e coltura di soma gangliari vestibolari e a spirale da roditori neonatali per registrazioni di patch-clamp. J. Vis. Exp. (2023).

Questo video mostra la tecnica del patch-clamp per misurare le correnti ioniche nei corpi cellulari dei neuroni sensoriali dell'orecchio interno. Descrive in dettaglio la preparazione e l'uso di una pipetta patch-clamp lucidata riempita con una soluzione interna contenente amfotericina B, che perfora la membrana per consentire il movimento degli ioni preservando le condizioni intracellulari. Gli impulsi di tensione vengono applicati per innescare e registrare l'attività dei canali ionici, fornendo informazioni sulle loro proprietà e sul loro comportamento.

Protocollo

1. Registrazione

NOTA: In questa procedura, le registrazioni patch-clamp dal ganglio isolato vengono tipicamente eseguite 12-24 ore dopo la placcatura. Altri laboratori hanno riportato risultati da neuroni dopo periodi molto più lunghi in coltura.

1. Preparare la camera di registrazione
   1. Utilizzare la camera di registrazione a sostituzione rapida (o equivalente) che consente di effettuare registrazioni con patch-clamp direttamente nel piatto di coltura. Impostare la camera sul microscopio invertito.
   2. Inserire le piastre di coltura con fondo di vetro nella camera.
   3. Alimentare la soluzione di L-15 attraverso un sistema di tubi di perfusione fino alla camera di registrazione. Stabilizzare il flusso e il deflusso di perfusione nella camera a una velocità di 0,5-1 ml al minuto.
2. Preparare la soluzione interna per il caricamento degli elettrodi
   1. Scongelare un'aliquota della soluzione interna del cerotto perforato. Allocare 2,5 mL di soluzione su una piastra di coltura da 35 mm. Riposizionare il coperchio sulla capsula di coltura ed etichettare come "Tip Dip". Mettere da parte in una zona priva di polvere, poiché è molto importante mantenere questa soluzione il più pulita possibile.
   2. Pesare 1 mg di amfotericina-B e aggiungere 20 μL di dimetilsolfossido (DMSO). Agitare e far girare la soluzione fino a quando tutta l'amfotericina-B è nella soluzione. Aggiungere 10 μl della soluzione di DMSO/amfotericina-B ai restanti 2 mL della soluzione interna del cerotto perforato scongelato. Prelevare ed estrarre la soluzione con una pipetta due o tre volte per assicurarsi che il DMSO/amfotericina-B si sia miscelato uniformemente nella soluzione interna. La soluzione avrà una leggera sfumatura giallastra.
   3. Aspirare la soluzione interna di amfotericina-B in una siringa da 3 mL. Aggiungere una punta da 34 g alla siringa. Avvolgere la siringa in un foglio di alluminio e tenere la siringa sul ghiaccio.
      nota: Questa soluzione deve essere rifatta ogni 2 ore per garantire l'efficacia dell'amfotericina-B nella perforazione della membrana cellulare. L'amfotericina-B è sensibile alla luce e deve essere protetta dalla luce utilizzando fogli di alluminio o altri metodi.
3. Registrazioni patch-clamp
   1. Visualizza i neuroni utilizzando un obiettivo 10x o 20x. Regola l'illuminazione e ottimizza l'ottica per vedere i confini e le ombre intorno alla cella.
   2. Controlla la qualità dei neuroni isolati. Tenta solo neuroni con superfici lisce e uniformi che non siano troppo contrastate e abbiano solo piccoli crateri dispersi. Inoltre, assicurati di evitare coppie di neuroni, neuroni circondati da detriti o altre cellule.
   3. Con un ingrandimento di 100x, identifica un neurone o un campo di neuroni da applicare e allineali al centro del campo visivo.
   4. Riempire la punta della pipetta con una soluzione pulita che non contenga amfotericina immergendo la punta (per ~20 s) nella soluzione pulita che è stata posta in un piatto di coltura. L'azione capillare attirerà una piccola quantità di soluzione nella punta.
      nota: Eseguire questo passaggio con un microscopio a stereodissezione, che consente di determinare quanto bene il puntale trattiene la soluzione Tip Dip. Se la soluzione non regge per ~10-20 s, la forma dell'elettrodo non è ideale. In questo caso, riconfigurare il programma di estrazione dell'elettrodo per produrre una punta più lunga.
   5. Quindi, riempire il retro della pipetta con la soluzione interna contenente amfotericina. Il filamento all'interno della pipetta aspira la soluzione verso il basso per incontrare la soluzione pulita nel puntale. Lasciare che il filamento tiri dolcemente la soluzione verso il basso e non tentare di eliminare le bolle, poiché ciò costringerebbe l'amfotericina a raggiungere la punta troppo velocemente.
   6. Utilizzare una siringa per estrarre la soluzione che potrebbe trovarsi nella parte posteriore dell'elettrodo.
      nota: È molto importante lavorare velocemente da questo punto verso terra e formare una tenuta ad alta resistenza sulla cella desiderata.
   7. Inserire la pipetta nel portapipetta. Verificare che la pipetta sia ben inserita nel supporto per evitare che la pipetta si sposti. Se la pipetta non è stabile, sostituire gli O-ring di tenuta nella parte anteriore e posteriore del supporto della pipetta per ridurre al minimo la deriva e mantenere una forte aspirazione. Sostituire la pipetta con una appena riempita.
   8. Abbassare la pipetta nel bagno della camera di registrazione.
   9. Posizionare il puntale della pipetta al centro del campo visivo. Assicurarsi che la punta sia priva di bolle d'aria o altri detriti.
   10. Applicare un passo di tensione (5 mV) nel test della membrana per monitorare la resistenza della pipetta. Continuare a monitorare la resistenza di ingresso durante l'intero processo di formazione di una tenuta sulla cella.
   11. Annullare il potenziale di offset della pipetta, in modo che la corrente della pipetta sia pari a zero nella modalità di test della membrana di pClamp.
   12. Correggere la capacità della pipetta utilizzando la funzione di compensazione rapida della capacità sull'amplificatore patch-clamp (quadranti rapidi Cp nel pannello morbido Multiclamp Commander).
   13. Spostare la pipetta verso il basso verso la cella.
   14. Una volta che la pipetta è abbastanza vicina al neurone, passare all'obiettivo con ingrandimento più elevato e inviare l'immagine attraverso una fotocamera a un monitor (utilizzare un obiettivo 40x, ingrandimento totale 400x). Regolare la pipetta e ricentrare il neurone.
   15. Avvicinare l'elettrodo di registrazione al soma. Individuare il centro del neurone sul monitor e posizionare l'elettrodo di registrazione sopra il neurone.
   16. Avvicinati al neurone dall'alto, in modo tale che l'elettrodo atterri al centro della cella sferica. Regolare l'offset della pipetta per azzerare i potenziali CC costanti nel sistema.
   17. Posizionare la pipetta vicino alla membrana. Atterra saldamente al centro della cella.
       nota: Durante l'atterraggio, si verificherà una piccola fossetta sulla superficie del neurone e un raddoppio/triplicazione della resistenza di input.
   18. Applicare una pressione negativa (aspirazione) utilizzando una siringa o una pipetta per bocca. Attivare il potenziale di mantenimento di -60 mV. La resistenza della tenuta dovrebbe aumentare fino a superare un giga-ohm.
       nota: Lavora velocemente per ridurre il tempo che intercorre tra il riempimento di un elettrodo e l'atterraggio su una cella. C'è un tempo limitato prima che l'amfotericina aggiunta alla soluzione interna del cerotto perforato raggiunga la punta dell'elettrodo. Una volta che la punta è contaminata da amfotericina, è difficile formare guarnizioni ad alta resistenza e la resistenza spesso si stabilizza a ~200 megaohm.
   19. Una volta formata una tenuta giga-ohm, rilasciare la pressione negativa. Non appena si forma la guarnizione, applicare la compensazione della capacità rapida per ridurre il più possibile l'ampiezza dei transitori di capacità della pipetta in modalità di test a membrana.
   20. Quando l'amfotericina inizia a funzionare, osservare come la resistenza di ingresso diminuisce lentamente e la corrente che scorre in risposta al passo di tensione di 5 mV aumenta progressivamente man mano che l'amfotericina entra nella membrana. Un'improvvisa diminuzione della resistenza in serie invece di una graduale stabilizzazione suggerisce che si è verificata una rottura spontanea.
   21. Stima la capacità dell'intera cella e la resistenza in serie utilizzando la funzione di annullamento dei transitori capacitivi dell'amplificatore. Documentare e monitorare la resistenza in serie all'inizio e regolarmente durante l'esperimento.
       nota: La resistenza in serie può richiedere da 5 a 20 minuti per stabilizzarsi, a seconda delle dimensioni dell'elettrodo e della quantità di soluzione pulita aspirata nella pipetta. Le modalità voltage-clamp e current-clamp possono essere utilizzate una volta che la resistenza in serie si è stabilizzata al di sotto di 30 megaohm. A volte si osserva un rigonfiamento o un restringimento dei neuroni durante la registrazione, ma raramente quando l'osmolarità e il pH delle soluzioni sono regolati correttamente.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
amfotericina	Sigma-Aldrich	A4888-100MG	Per registrazioni di patch perforate.
ATP di-sodico	Sigma-Aldrich	Codice: A7699	Additivo alla soluzione interna
CaCl2	J.T. Baker	Codice: 1311-01	Additivo alla soluzione interna
Dmso	Biozio	Codice 90082
EGTA	Sigma-Aldrich	E 0396	Additivo alla soluzione interna
Estrattore di elettrodi	Narashige	PC-10
etanolo	Laboratori Decon	Codice: 2716	per la testina di pulizia e intorno al banco di dissezione
Capillari in borosilicato filamentato per elettrodi	Strumenti Sutter	BF140-117-10
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-100G	per tamponare il pH di tutte le soluzioni in protocollo
Piastra riscaldante / agitatori magnetici	VWR	Codice: 76549-914
K2SO4, solfato di potassio	Sigma Aldrich	P9458-250G	Additivo alla soluzione interna
Kcl	Sigma-Aldrich	P93333	Additivo alla soluzione interna
KOH (1 M)	Honeywell	319376-500ML	Per portare la soluzione interna al pH desiderato.
Camera di registrazione a bagno a basso profilo per piastre di coltura	Strumenti Warner	Codice 64-0236
MgCl 2-esaidrato	Sigma-Aldrich	Motore M1028	Additivo alla soluzione interna
Ago microFil per il riempimento di micropipette - Calibro 34	Strumenti di precisione mondiali	MF34G
Microforgia	Narashige	MF-90	Per la lucidatura ad elettrodo.
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	Additivo alla soluzione interna
NaOH (1 m)	Thomas Scientific	319511-500ML	per titolazione di pH
Ossigeno, grado medico, con regolatore e tubi adeguati	Gestione dei materiali USC	MEDOX200 (Identificatore: 00015)	per la dissoluzione in soluzioni di dissezione e bagno
Vetro rivestito in poli-d-lisina con fondo piatto di coltura	Mattek	P35GC-0-10-C	per piastrare, neuroni per coltura
Filtri a membrana PES , 0,2 micrometri	Nalgene	566-0020	per soluzioni filtranti
Filtri per siringhe sterili con membrana in PES, 0,22 um, 30 mm	CELLTREAT	229747	per soluzioni filtranti aspirate in siringhe
Misuratore di pH	Mettler Toledo	Modello S20
Cella di riferimento	Strumenti di precisione mondiali	RC1T
Scala scientifica	Mettler Toledo	XS64
Pallone tarato da 1000 millilitri
Acqua sterile in poliuretano, R>18,18 megaOhm cm (ad es. filtrata con un sistema di purificazione dell'acqua Millipore-Sigma)	Millipore-Sigma	CDUFBI001