Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione dell'elettrodo (Figura 1A-C)
NOTA: I pin loci del computer sono semplicemente un contatto a punta come parte dell'interfaccia del segnale nei dispositivi di comunicazione. È costituito da un connettore maschio che si inserisce nel connettore femmina.
- Separare con cura i pin maschio e femmina dai loci dei pin del computer (Figura 1A) con l'aiuto di una pinza. Collegare i pin maschio e femmina insieme per formare un elettrodo e applicare cianoacrilato per creare un forte legame adesivo (Figura 1C).
- Mettere gli elettrodi in un becher pieno di acqua distillata e metterlo nel pulitore a ultrasuoni per 10 minuti. Spostarli in un forno di essiccazione a 45 °C per 30 minuti. Sterilizzare gli elettrodi utilizzando la luce ultravioletta (UV) per 30 minuti.
2. Procedura chirurgica (Figura 1D-F)
- Preparare gli strumenti chirurgici sterilizzati e l'apparato stereotassico. Anestetizzare il cucciolo di ratto neonatale utilizzando l'anestesia con isoflurano (2,5%) con aria. Quando il cucciolo è profondamente anestetizzato, regolare la dose di isoflurano all'1,0%. Eseguire un pizzicamento della coda o delle dita dei piedi prima dell'intervento chirurgico per garantire la corretta profondità dell'anestesia.
- Fissare la testa del cucciolo nell'apparato stereotassico posizionando le barre auricolari nei canali uditivi e stringendole leggermente.
nota: Non stringere eccessivamente le barre auricolari, poiché il cranio neonatale è molto morbido.
- Mantenere il campo chirurgico sterile spruzzando tutte le apparecchiature con etanolo al 70%. Praticare un'incisione di 15 mm sulla testa utilizzando un bisturi. Usando una pinza, allontana delicatamente il cuoio capelluto dalla linea mediana ai quattro angoli. Metti del cotone imbevuto di soluzione salina sotto la pelle per mantenere l'incisione completamente aperta (Figura 1D).
- Trova i punti bregma e lambda sul teschio e segnali con una matita. Utilizzare un ago per siringa (26 G) per praticare due fori nella corteccia prefrontale (PFC) e nell'ippocampo.
nota: La PFC si trova a +1,8 mm posteriormente alla bregma e a -0,5 mm lateralmente alla linea mediana, mentre l'ippocampo si trova a -2,0 mm anteriormente alla bregma e a ±0,5 mm lateralmente alla linea mediana (Figura 1D ed E). La profondità dell'elettrodo non deve essere superiore a 2 mm al di sotto della superficie corticale per ridurre al minimo i danni cerebrali.
- Utilizzare una pinza per tenere gli elettrodi e inserire gli elettrodi di riferimento e di registrazione rispettivamente nel PFC e nell'ippocampo. Applicare unguento all'eritromicina attorno all'elettrodo per evitare ogni possibile infezione. Fissare l'elettrodo utilizzando cianoacrilato.
- Preparare il cemento acrilico dentale in modo che abbia una consistenza collosa e viscosa. Applicare il cemento dentale per coprire gli elettrodi e il resto del cranio.
nota: Asciugare accuratamente il cranio prima di applicare il cemento dentale.
- Applicare acido picrico al 5% sugli elettrodi per proteggerli.
nota: L'intera procedura deve essere eseguita in una cappa di biosicurezza per mantenere le condizioni sterili.
- Rimuovere l'animale dal telaio stereotassico e iniettare 300 μl di glucosio al 10% per via sottocutanea. Mettilo su una coperta riscaldata per il recupero. Assicurarsi che l'animale sia caldo (37 °C) e deambulante (cioè completamente guarito). Somministrare buprenorfina per via intraperitoneale (0,05 mg/kg) per il dolore post-chirurgico.
nota: Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza (cioè comportamento e movimento normali).
- Riporta il cucciolo nella sua gabbia di casa con la loro madre dopo che ha ripreso conoscenza. Attendere due giorni fino a quando l'animale non si è completamente ripreso.
3. Registrazione EEG
- Dopo il completo recupero, collegare gli elettrodi impiantati sul cranio del cucciolo all'amplificatore nella propria gabbia. Collegare l'amplificatore a un convertitore analogico/digitale e collegare il convertitore a un computer; Le linee di collegamento devono essere trattate con cura in modo che non si aggroviglino.
- Selezionare una frequenza di campionamento di almeno 10.000 Hz sull'unità di acquisizione dati per la registrazione (la larghezza di banda del trasmettitore è 1-100 Hz). Assicurarsi che i dati siano campionati correttamente.
- Dopo aver ottenuto la registrazione di base, iniettare il cucciolo per via intraperitoneale con acido kainico (KA, 2 mg/kg) per indurre le crisi epilettiche. 15 minuti dopo l'iniezione di KA, osservare e registrare le scariche epilettiche. Le convulsioni prodotte attraverso KA sono solitamente fisiche.
NOTA: La durata ictale-tonica è di circa 15,2 ±0,9 s, la durata delle crisi è di circa 62±5 s. Le convulsioni possono essere prevenute nel ratto neonatale somministrando un'iniezione IP di idrato di cloralio (400 mg/kg).
- Salva i dati digitalizzati e analizzali utilizzando pacchetti software di elaborazione del segnale, come spike2. Rivela il livello di potenza di diverse componenti di frequenza nel segnale EEG neonatale eseguendo un'analisi dello spettro di potenza. Calcola la potenza in un intervallo di tempo di 1 minuto trovando l'ampiezza quadratica media da 1 a 100 Hz (banda EEG).
