Registrazione accoppiata con patch clamp delle connessioni neuronali in fette cerebrali acute

Abstract

Fonte: Qi, G., et al. Caratterizzazione elettrofisiologica e morfologica di microcircuiti neuronali in fette cerebrali acute utilizzando registrazioni patch-clamp accoppiate. J. Vis. Exp. (2015)

Questo video mostra la procedura per mappare le connessioni sinaptiche fissando una fetta di cervello, posizionando pipette per ottenere configurazioni di cellule intere e stimolando i neuroni presinaptici a registrare le risposte postsinaptiche, chiarendo così la connettività neuronale.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Registrazione accoppiata Patch-Clamp e riempimento di biocitina

A seconda del tipo di connessione sinaptica, vengono utilizzati tre diversi approcci per trovare neuroni accoppiati sinapticamente. Se la probabilità di connessione è bassa (come ci si può aspettare per la maggior parte delle connessioni eccitatorie), procedere come segue:

1. Connessioni neuronali con una bassa connettività
   1. Riempire le pipette per cerotti con una soluzione interna della composizione elencata nella Tabella 1. Per tutte le registrazioni nella configurazione a cellula intera, aggiungere biocitina a concentrazioni comprese tra 3 e 5 mg/ml alla soluzione interna (pipetta) per ottenere buoni risultati di colorazione per i neuroni pre e postsinaptici. Lasciare che la biocitina si diffonda nella cellula per almeno 15 - 30 minuti (a seconda delle dimensioni del neurone).
      NOTA: Non aggiungere biocitina alla soluzione utilizzata nelle pipette di "ricerca" menzionate di seguito.
   2. Patch a un presunto neurone postsinaptico in modalità cellula intera. Utilizzare pipette patch con gambo lungo e sottile. Ciò facilita la manovrabilità della pipetta sotto l'obiettivo e riduce gli artefatti di movimento che possono verificarsi quando l'elettrodo viene introdotto nella fetta.
   3. Quindi, applicare un patch a un potenziale neurone presinaptico in una configurazione collegata alla cellula utilizzando una pipetta per cerotti "di ricerca" con resistenza di 8-10 MΩ e un diametro della punta ridotto. Queste pipette stabiliscono un cerotto "sciolto" attaccato alle cellule. Riempire la pipetta di "ricerca" con una soluzione interna in cui K⁺ è sostituito da Na⁺ (Tabella 2) per evitare che i neuroni si depolarizzino durante la ricerca di una cellula presinaptica.
      NOTA: La resistenza di tenuta "allentata" non è nell'intervallo GΩ, ma in genere intorno a 30 - 300 MΩ.
   4. Mantenere il potenziale della membrana sotto la guarnizione "allentata" a circa -30--60 mV in modalità pinza amperometrica. Quindi, applicare impulsi di corrente di grandi dimensioni (0,2 - 2 nA) per suscitare un potenziale d'azione nella potenziale cellula presinaptica. Osservare questo potenziale d'azione come un piccolo spicchio sulla risposta di tensione.
   5. Impostare la frequenza di stimolazione su 0,1 Hz per evitare un esaurimento di una risposta postsinaptica. Utilizzare frequenze di stimolazione più basse se il tessuto cerebrale è molto immaturo o la connessione sinaptica non è molto affidabile.
   6. Nel caso in cui il neurone "postsinaptico" non risponda alla stimolazione del neurone "presinaptico" testato, applicare un patch a un nuovo neurone in modalità sigillo "sciolto". Non sostituire l'elettrodo patch di "ricerca" finché è stabilita la guarnizione con una resistenza di >30 MΩ. In questo modo, testare fino a 30 neuroni potenzialmente presinaptici.
      nota: Per evitare di danneggiare il neurone durante la procedura di ricerca con un patch clamp allentato, è necessario applicare solo un'aspirazione delicata alla pipetta di ricerca rispetto a quella applicata alla patch pipetta a cellule intere.
   7. Se la stimolazione in modalità sigillo "sciolto" provoca un EPSP/IPSP (potenziale postsinaptico eccitatorio/potenziale postsinaptico inibitorio) con una latenza <5 msec nel neurone postsinaptico, rimuovere la pipetta "di ricerca" dal neurone presinaptico.
   8. Sostituire la pipetta patch "di ricerca" con un elettrodo patch riempito con una soluzione interna regolare contenente biocitina. Assicurarsi che questa pipetta per patch di registrazione abbia una resistenza di 4 - 8 MΩ; Maggiore è la dimensione del SOMA, minore può essere la resistenza dell'elettrodo.
   9. Applicare patch al neurone presinaptico e registrare in modalità current-clamp a cellula intera. Suscita potenziali d'azione mediante iniezione di corrente nei neuroni presinaptici e registra la risposta postsinaptica. Archiviare i dati in un computer per una successiva analisi offline.

Tabella 1. Soluzione per pipette a basso contenuto di cloruro.

	millimetro	g/L	g/50 ml
K-gluconato	135	31.622	1.5811
Kcl	4	0,298	0,0149
HEPES	10	2.384	0,1192
creatinfosfato	10	2.552	0,1276
ATP-Mg2+	4	2.028	0,1014
GTP-NA	0,3	0,156	0,0078
Regola il pH a 7.3 con KOH
Osmolarità ~300 mOsmol/L
Aggiungi 3 - 5 mg/ml di biocitina

Tabella 2. Soluzione di pipetta ad alto contenuto di Na per la ricerca di neuroni accoppiati sinapticamente.

	millimetro	g/L	g/50 ml
Na-gluconato	105	22.92	1.146
NaCl	30	1.76	0,088
HEPES	10	2.384	0,1192
creatinfosfato	10	2.552	0,1276
ATP-Mg2+	4	2.028	0,1014
GTP-NA	0,3	0,156	0,0078
Regola il pH a 7.3 con NaOH
Osmolarità ~300 mOsmol/L

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
amplificatore	HEKA	EPC 10 USB Triplo	con 2-3 preamplificatori
microscopio	Olimpo	BX51WI	con 2 porte per fotocamera e un obiettivo da 4×, un obiettivo a immersione in acqua da 40×
macchina fotografica	TILL Fotonica	VX55	telecamera CCD a infrarossi
workstation	Luigs & Neumann	Infrapatch 240	Con tavolino X-Y motorizzato e asse di messa a fuoco motorizzato per il microscopio
Micromanipolatore	Luigs & Neumann	SM-5	Manipolatori X-Y-Z per 2-3 preamplificatori
gabbia di Faraday	Luigs & Neumann
Tavolo antivibrante	Spettri di Newport-Fisica
Patchmaster	HEKA
microtomo	Microm Internazionale	HM650V
Estrattore per micropipette	HEKA	Sutter P-97
Sistema Neurolucida	Microcampo chiaro		con i software Neurolucida e Neuroexplorer