Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Registrazioni con Patch Clamp
- Posizionare la soluzione dell'elettrodo (vedere la Tabella 1) sul ghiaccio per evitare la degradazione. Riempire la pipetta con cerotto in vetro con soluzione intracellulare filtrata (filtro per siringa, dimensione dei pori: 0,2 μm) e posizionare la pipetta nel portapipetta dello stadio principale. Applicare una leggera pressione positiva sulla pipetta attraverso una siringa da 5 ml spostando lo stantuffo di circa 1 ml prima di immergere la pipetta nella soluzione del bagno.
Nota: In questo modo si evita che la pipetta si ostruisca.
- Scegli la modalità "V-clamp" ruotando la manopola della modalità sull'amplificatore, quindi apri l'interfaccia "Test membrana" nel software. Avvicinare la pipetta al neurone bersaglio sotto ispezione al microscopio.
nota: Nella preparazione DRG intatta, un sottile strato di cellule gliali satelliti incapsula ciascun neurone.
- Utilizzare la pressione positiva della pipetta per attraversare lo strato di cellule gliali satelliti fino a quando non si osserva un improvviso allargamento dello spazio tra il neurone e lo strato circostante di cellule gliali satelliti. Continuare a muovere la pipetta verso il neurone fino a quando non si osserva una "fossetta" sul neurone.
nota: Rispetto alle registrazioni dei neuroni dissociati, la pressione positiva deve essere leggermente più grande, il che aiuterà a penetrare lo strato di cellule gliali satelliti e ad aumentare le possibilità di successo del patching.
- Ridurre la pressione positiva. Successivamente, ottieni una tenuta giga ohm con un'aspirazione delicata.
nota: Con questo metodo, il tasso di successo della registrazione è almeno del 70%.
- Ottenere la configurazione di registrazione dell'intera cella come descritto in precedenza.
- Penetrare brevemente la membrana cellulare del neurone attraverso una breve ma forte aspirazione. In alternativa, utilizzare la funzione "zap" dell'amplificatore mentre è applicata l'aspirazione.
- Una volta stabilita una modalità a cella intera, compensare la capacità a cella intera e la resistenza in serie (Rs) ruotando le manopole di compensazione della capacità e della resistenza sul amplificatore.
nota: Rs è normalmente 5-20 MΩ.
- Abbandonare la cella se Rs è inizialmente maggiore di 30 MΩ o cambia di oltre il 20% durante la registrazione. Inoltre, misurare il potenziale di membrana a riposo; abbandonare una cella se è superiore a -50 mV.
- Chiudere la finestra "Test membrana". Scegli la modalità "I-clamp normale" ruotando la manopola della modalità sul amplificatore.
- Fare clic su "apri protocollo" nel software, selezionare e caricare il protocollo per la misurazione della reobase. Fare clic su "registra" per avviare la registrazione. Misurare la resistenza in ingresso e la reobase per esaminare l'eccitabilità neuronale iniettando una serie graduata di correnti depolarizzanti in incrementi di 100 pA.
- Fare clic su "apri protocollo" nel software, selezionare e caricare il protocollo per la misurazione della reobase. Fare clic su "registra" per avviare la registrazione. Misurare la resistenza in ingresso e la reobase per esaminare l'eccitabilità neuronale iniettando una serie graduata di correnti depolarizzanti in incrementi di 100 pA.
- Utilizzare un software di acquisizione e analisi dei dati (ad es. Clampfit) per analizzare le tracce registrate secondo le istruzioni del produttore. Il software calcola la resistenza di ingresso (Rin) in base alla relazione I-V allo stato stazionario durante le correnti iperpolarizzanti erogate. Spostare il cursore per misurare il valore della reobase e della soglia della membrana. nota: L'ampiezza della corrente richiesta per indurre l'AP è definita come reobase e la tensione più bassa per indurre l'AP è definita come soglia di membrana.
- Registrare le correnti indotte dal ligando.
- Riempire una pipetta con gli agonisti specifici.
Nota: Nel presente rapporto, abbiamo utilizzato 100 μM di glutammato e 100 μM di AITC per indurre le correnti mediate rispettivamente dai recettori del glutammato e dai recettori TRPA1.
- Controllare la pipetta per assicurarsi che non ci siano bolle d'aria all'interno. Posizionare la pipetta nel portapipetta. Collegare il portapipetta con un tubo collegato a un sistema di erogazione dei farmaci.
- Utilizzare il manipolatore per spostare la pipetta entro 50 μm dal neurone. Impostare la pressione del sistema di erogazione del farmaco su 1 psi e la durata su 1 sec. Passare dalla modalità di registrazione al morsetto di tensione e al morsetto a -70 mV. Applicare brevemente la pressione tramite il sistema di erogazione del farmaco per registrare una corrente indotta dal farmaco.
Tabella 1
| 100 ml di soluzione intracellulare |
| Concentrazione (mM) | componente | Mw | g |
| 130 | KGluconato | 234,24 | |
| 10 | Kcl | 74,55 | |
| 10 | HEPES | 238,3 | |
| 10 | EGTA | | |
| numero arabo | MgCl2*6H2O | 203,3 | |
| Note: Regola il pH a 7.4 con KOH e l'osmolarità a 260 - 280 mOsm con saccarosio e acqua distillata. Aggiungere 2 mM di MgATP, 0,5 mM di Na2GTP e filtrare prima dell'uso immediato. |
