Valutazione delle sinapsi a nastro in regioni di frequenza specifiche della coclea di topo

Abstract

Fonte: Yu, S., et al. Valutazione morfologica e funzionale delle sinapsi a nastro in specifiche regioni di frequenza della coclea di topo. (2019).

Questo video mostra un metodo per valutare le sinapsi a nastro in regioni specifiche della coclea di topo. Utilizza tecniche di immunocolorazione e imaging confocale per identificare le sinapsi funzionali in diverse regioni di frequenza in ogni giro cocleare.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono la manipolazione degli animali sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Selezione degli animali

1. Per tutti gli esperimenti, utilizzare topi maschi adulti C57BL/6J (8 settimane di età) come modello animale.
   NOTA: I topi C57BL/6J portatori di una variante di splicing del Cdh23 mostrano una senescenza accelerata nel sistema uditivo, che si riflette in una perdita del 40% delle sinapsi a nastro al giro basale della coclea e una perdita del 10% al giro centrale entro i 6 mesi di età, seguita da un rapido aumento di questa perdita nell'intera coclea con l'età. Pertanto, consigliamo cautela quando si utilizzano topi C57BL/6J di età superiore a 6 mesi per la ricerca uditiva. Altri ceppi di topi possono essere utilizzati a seconda di specifici obiettivi sperimentali.
2. Ispeziona i topi utilizzando un otoscopio tascabile diagnostico professionale per escludere patologie dell'orecchio esterno o medio prima di effettuare valutazioni dell'udito. I potenziali segni possono includere liquido o pus nel canale uditivo esterno, arrossamento e gonfiore nel tessuto locale e perforazione della membrana timpanica><. NOTA: Sebbene questo si incontri raramente, una volta identificati, i topi con malattie dell'orecchio esterno o medio dovrebbero essere esclusi.

2. Valutazione dell'udito

1. Anestetizzare i topi utilizzando un'iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina cloridrato (100 mg/kg) e xilazina cloridrato (10 mg/kg). Giudicare la profondità dell'anestesia attraverso stimoli dolorosi (ad esempio, il riflesso del pizzicamento delle dita dei piedi).
   NOTA: Quando il riflesso del pizzicamento del dito del piede è completamente assente, l'animale ha raggiunto una profondità di anestesia adeguata per i test uditivi. Se è necessario più tempo per le registrazioni bilaterali ABR (risposta uditiva del tronco encefalico), somministrare un dosaggio più basso (un quinto del dosaggio originale) di anestetici per ripristinare il piano anestetico originale. Fare attenzione a evitare il sovradosaggio di anestetico, poiché ciò può portare alla morte nei topi.
2. Mantenere la temperatura corporea dell'animale anestetizzato a 37,5 °C utilizzando un termoforo termoregolatore. Posizionare l'animale anestetizzato in una stanza schermata elettricamente e acusticamente per evitare interferenze durante il test dell'udito.
   NOTA: Mantenere la temperatura fisiologica durante l'intera procedura fino a quando l'animale non è completamente sveglio al fine di prevenire la morte causata dall'ipotermia post-anestesia.
3. Posizionare gli elettrodi ad ago sottocutanei (20 mm, 28 G) al vertice del cranio (elettrodo di registrazione), nella regione parotide omolaterale al di sotto del padiglione auricolare misurato (elettrodo di riferimento) e nella regione parotide controlaterale (elettrodo di terra), con una profondità di 3 mm sotto la pelle della testa del topo, rispettivamente.
4. Utilizzare un altoparlante a campo chiuso per eseguire la stimolazione acustica tramite un tubo di plastica di 2 cm con una punta a forma di cono. Inserire la punta nel condotto uditivo esterno.
   NOTA: Assicurarsi che l'impedenza elettrica negli elettrodi di registrazione e di riferimento sia inferiore a 3 kOhm (di solito 1 kOhm). Se l'impedenza è elevata, cambiare il sito di inserimento dell'elettrodo, pulire l'elettrodo con alcool o sostituire l'elettrodo per evitare alterazioni dell'ampiezza dell'onda ABR.
5. Per la registrazione ABR, generare pip di tono (durata 3 ms, tempi di salita/discesa di 1 ms, a una velocità di 21,1/s, frequenza: 4–48 kHz) e presentarli a livelli di pressione sonora decrescenti (SPL) da 90 a 10 dB in incrementi di 5-10 dB SPL. Durante questa fase, le risposte vengono amplificate (10.000 volte), filtrate (0,1-3 kHz) e mediate (1.024 campioni/livello di stimolo).
   NOTA: Gli ABR vengono raccolti per ogni livello di stimolo in incrementi di 10 dB, con ulteriori incrementi di 5 dB vicino alla soglia.
6. Ad ogni frequenza, determinare la soglia ABR, che si riferisce all'SPL minimo che si traduce in una registrazione ABR affidabile con una o più onde distinguibili che possono essere chiaramente identificate dall'ispezione visiva.
   NOTA: Di solito è necessario ripetere il processo per SPL bassi intorno alla soglia per garantire la coerenza delle forme d'onda. La soglia di risposta è il livello di stimolo più basso al quale la forma d'onda può essere osservata quando una diminuzione di 5 dB porterebbe alla scomparsa della forma d'onda.

3. Processamento del tessuto cocleare

1. Dopo la registrazione ABR, sopprimere i topi anestetizzati tramite lussazione cervicale, decapitarli, esporre la bolla dal lato ventrale e aprirli con forbici affilate per accedere alla coclea.
2. Usando una pinza sottile, rimuovere le ossa temporali, recidere l'arteria della staffa, rimuovere la staffa dalla finestra ovale e rompere la membrana rotonda della finestra. Fare un piccolo foro all'apice della coclea ruotando delicatamente la punta di un ago (13 mm, 27 G).
3. Fissare le ossa isolate con paraformaldeide al 4% (wt/vol) in soluzione salina tamponata con fosfato 0,1 M (PBS, pH 7,4) per una notte a 4 °C. Utilizzando una pipetta a punta fine, sciacquare delicatamente il fissativo attraverso gli spazi perilinfatici mediante l'applicazione alle finestre ovali o rotonde (come ingresso) e all'apertura all'apice (come uscita).
   NOTA: Alcune proteine richiedono una breve durata di fissazione per evitare la distruzione dei loro epitopi per l'immunomarcatura. In tali casi, incubare le ossa in paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente (RT) per 2 ore, a seconda delle istruzioni del produttore per l'immunoistochimica. La fissazione può essere eseguita anche tramite perfusione cardiaca per rimuovere il sangue cocleare, evitando il rumore di fondo dovuto a colorazioni non specifiche nelle fasi successive, in particolare nei modelli murini di sinaptopatia cocleare.
4. Sciacquare le ossa tre volte per 5 minuti con PBS freddo 0,1 M per rimuovere la paraformaldeide residua. Decalcificare le ossa con acido etilendiamminotetraacetico al 10% (EDTA) a RT per 4 ore o a 4 °C per 24 ore agitando delicatamente in uno shaker orizzontale a 20 giri/min. L'EDTA può essere aggiornato a metà strada.
   NOTA: I tempi di decalcificazione sono soggetti alla concentrazione di EDTA e alle preferenze degli utenti. Il tessuto decalcificato deve mantenere un certo grado di tenacità, il che facilita la manipolazione delle montature cocleari intere isolanti nelle fasi successive. Le ossa temporali possono essere decalcificate in EDTA al 10% con rotazione, consentendo ai ricercatori di lasciare il laboratorio dopo i test ABR e gli esperimenti di fissazione. Il tempo di decalcificazione è flessibile nell'intervallo da 20 a 30 ore a 4 °C.
5. Trasferire un osso temporale decalcificato da EDTA a 0,1 M PBS. Utilizzare le pinze Dumont #3 e #5 e l'ago da 27 G per sezionare a turno le regioni cocleare apicale, media e basale e quindi sezionare la coclea dall'osso con un microscopio a dissezione stereoscopica. Fai una serie di piccoli tagli lungo il legamento a spirale usando una lama di rasoio e rimuovi la membrana tectoriale e la membrana di Reissner (Figura 1).
   NOTA: Finché la coclea sezionata è intatta, questo processo può essere modificato secondo il protocollo abituale del singolo operatore.
6. Sezionare ulteriormente l'epitelio uditivo rimanente, compreso il limbus a spirale, in singoli giri cocleari (apice, centro e base con regione dell'uncino) per le preparazioni dell'intera montatura.
7. Con un obiettivo ad olio 40x di un microscopio ottico, misurare la lunghezza della membrana basilare con una scala di 250 μm posta nell'oculare, che può essere regolata lungo le stereociglia degli IHC.
8. Calcolare la lunghezza di ogni giro cocleare sommando tutte le lunghezze dei segmenti (250 μm per segmento) e ottenere contemporaneamente la lunghezza totale della membrana basilare sommando le lunghezze di ciascun giro.
9. Convertire la lunghezza totale della membrana basilare, compresa la regione dell'uncino, in una percentuale basata sulla distanza dall'apice cocleare (0% si riferisce all'apice cocleare, 100% alla base cocleare).
10. Converti questa distanza nella frequenza caratteristica cocleare utilizzando una funzione logaritmica (d(%) = 1 - 156,5 + 82,5 × log(f), con una pendenza di 1,25 mm/ottava di frequenza, dove d è la distanza normalizzata dall'apice cocleare in percentuale, f è la frequenza in kHz), come descritto in precedenza. In questo modo è possibile acquisire l'intervallo di frequenza in un'area corrispondente della membrana basilare su ogni giro cocleare.

4. Colorazione in immunofluorescenza

1. Dopo la dissezione, posizionare ogni giro cocleare in una provetta da centrifuga separata da 2,5 mL e incubare i giri cocleari in siero di capra al 10% / PBS / 0,1% Triton X-100 per 1 ora a RT su un rotatore.
2. Rimuovere la soluzione di bloccaggio/permeabilizzazione di cui sopra da ciascuna provetta utilizzando un puntale per pipetta da 200 μL al microscopio da dissezione e incubare i campioni con anticorpi primari diluiti in siero di capra al 5%, PBS/Triton X-100 allo 0,1% per una notte a 4 °C su un rotatore.
   NOTA: Per l'immunomarcatura dei nastri sinaptici cocleari, utilizzare il marcatore presinaptico di topo anti-carbossil-terminale proteina legante 2 IgG1 (CtBP2, che marcava il dominio B della proteina di impalcatura RIBEYE, 1:400) e il marcatore postsinaptico di topo anti-recettore del glutammato 2 IgG2a (GluR2, che marcava una subunità dell'acido α-ammino-3-idrossi-5-metil-4-isossazolopropionico o recettore AMPA, 1:200).
3. Sciacquare tre volte per 5 minuti con PBS freddo 0,1 M per rimuovere gli anticorpi primari residui e incubare i campioni con anticorpi secondari diluiti in siero di capra al 5% / PBS / Triton X-100 allo 0,1% a RT per 2\u20123 ore al buio su un rotatore.
   NOTA: Preparare miscele di anticorpi secondari appropriate utilizzando Alexa Fluor 568 (IgG1, 1:500) e Alexa Fluor 488 (IgG2a, 1:500) e Alexa Fluor 488 (IgG2a, 1:500), che sono complementari agli anticorpi primari utilizzati al punto 4.2. Per migliorare l'efficienza della marcatura dei nastri sinaptici, si consiglia di selezionare anticorpi secondari specifici. Alcuni laboratori estendono l'incubazione con anticorpi secondari per aumentare l'immunomarcatura di GluR2.
4. Sciacquare tre volte per 5 minuti con 0,1 M di PBS per rimuovere gli anticorpi secondari residui e trasferire i campioni da provette da centrifuga da 2,5 mL a piastre da 35 mm contenenti 0,1 M di PBS.
5. Posizionare una goccia di terreno di montaggio contenente 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) sul vetrino e trasferire i campioni dal PBS al mezzo di montaggio. Posizionare un bordo di un vetrino coprioggetti sul vetrino e rilasciarlo per far cadere delicatamente il vetrino coprioggetti.
   NOTA: Per garantire che le cellule ciliate siano rivolte verso l'alto e che non si verifichino piegature o torsioni dei campioni cocleari durante la procedura, montare i campioni cocleari sotto un microscopio a dissezione stereoscopica.
6. Posizionare i vetrini in una scatola per vetrini a 4 °C durante la notte per lasciarli asciugare e quindi eseguire l'imaging con un microscopio confocale laser.

5. Valutazione morfologica delle sinapsi a nastro cocleare

1. Diapositive di immagini utilizzando un microscopio confocale con tre laser: un diodo UV da 405 nm, un laser ad argon da 488 nm e un laser a stato solido pompato con diodi (DPSS) da 561 nm per eccitare DAPI (spettro di eccitazione 409-464 nm), Alexa Fluor 488 (spettro di eccitazione 496-549 nm) e Alexa Fluor 568 (spettro di eccitazione 573-631 nm), rispettivamente.
2. Acquisizione di z-stack confocali su una distanza di 8 μm da ciascun giro cocleare utilizzando una lente a immersione in olio ad alta risoluzione 63x.
   NOTA: Una volta definiti, tutti i parametri per la digitalizzazione delle micrografie fotografiche devono essere salvati e applicati in modo uniforme a tutte le diapositive.
3. Per la conta dei punti sinaptici, impostare le pile z (dimensione del passo di 0,3 μm) in modo che si estendano per l'intera lunghezza delle cellule ciliate interne (IHC), assicurando così che tutti i punti sinaptici possano essere visualizzati.
4. Unisci le immagini contenenti puncta in uno z-stack per ottenere la proiezione dell'asse z e importale nel software di elaborazione delle immagini.
5. Dividi i conteggi totali sinaptici in ogni z-stack a specifiche regioni di frequenza per il numero di IHC (pari ai conteggi manuali nucleari DAPI) per calcolare il numero di punti sinaptici per ciascun IHC. In ogni specifica regione di frequenza, fare la media di tutti i punti sinaptici in tre immagini di diversi campi microscopici contenenti 9-11 IHC.
   1. Delinea la regione di interesse (ROI), comprese le regioni basolaterali di ciascun IHC, utilizzando il pulsante di selezione a mano libera. Utilizza la funzione di misura per la quantificazione automatica dei punti e la funzione spartiacque per distinguere tra punti strettamente adiacenti.
   2. Dopo ogni conteggio automatico, eseguire ispezioni visive con correzioni manuali per garantire che il conteggio dei puncta sia affidabile.
      NOTA: Gli sperimentatori devono rimanere accecati sul fatto che il vetrino provenga dall'apice, dal centro o dal giro basale della coclea.
6. Valuta visivamente la struttura e la distribuzione sinaptica per isolare manualmente i singoli IHC dai loro vicini con lo strumento Pencil (M) per visualizzare meglio l'architettura citoscheletrica e la localizzazione sinaptica.
7. Per ispezionare la giustapposizione dei nastri presinaptici (CtBP2) e dei cerotti recettoriali postsinaptici (GluR2), estrarre lo spazio voxel attorno al nastro con lo strumento Selezione rettangolare e isolare il singolo nastro mediante Ritaglio. Facendo clic su Immagine > Dimensioni immagine, acquisire una serie di miniature di queste proiezioni in miniatura, che possono quindi essere utilizzate per identificare le sinapsi accoppiate (apparse come coppie strettamente giustapposte di punti CtBP2-positivi e GluR2-positivi) rispetto ai nastri orfani (privi di patch postsinaptiche per il recettore del glutammato) (Figura 2).
   NOTA: Le sinapsi cocleari normali appaiono come immunomarcatura combinata del nastro presinaptico all'interno della cellula ciliata (anti-CtBP2) e del cerotto del recettore del glutammato postsinaptico sul terminale del nervo uditivo (anti-GluR2). Alcuni laboratori utilizzano proiezioni confocali in combinazione con la modellazione 3D per quantificare le dimensioni o il volume dei cerotti sinaptici. Prima di una perdita significativa delle sinapsi a nastro, i nastri che mostrano cambiamenti di dimensioni o senza patch accoppiate del recettore del glutammato sono probabilmente indicativi di disfunzione sinaptica.

Risultati

Figura 1: Localizzazione della frequenza cocleare nei topi. (A) Un'immagine rappresentativa della coclea completamente espiantata, che è stata sezionata dall'osso temporale con un microscopio a dissezione stereoscopica. (B) La coclea del topo è divisa in giri apicali, medi e basali, dove la parete laterale cocleare viene rimossa. I cerchi rossi sui f...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cloridrato di ketamina	Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, Cina	H35020148	100 mg/kg
Xilazina cloridrato	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti	X-1251	10 mg/kg
Apparecchio per fisiologia TDT	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, Stati Uniti	Sistema di Fisiologia Uditiva III
Software SigGen/BioSig	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, Stati Uniti	Sistema di Fisiologia Uditiva III
Pad elettrico	Divertimento con gli animali domestici	11072931136
Pinza Dumont 3#	Strumenti di Fine Science, North Vancouver, B.C., Canada	0203-3-PO
Pinze Dumont 5#	Strumenti di Fine Science, North Vancouver, B.C., Canada	0209-5-PO
Microscopio per dissezione stereo	Nikon Corp., Tokyo, Giappone	SMZ1270
Siero di capra	ZSGB-BIO, Pechino, Cina	ZLI-9021
Anti-recettore 2 del glutammato, extracellulare, clone 6C4	Millipore Corp., Billerica, MA, Stati Uniti	Visualizzazione MAB397	topo
Topo Purificato Anti-CtBP2	BD Biosciences, Billerica, MA, Stati Uniti	612044	topo
Alexa Fluor 568 capra anti-topo IgG1anticorpo	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, Stati Uniti	Codice: A21124	capra
Alexa Fluor 488 capra anti-topo anticorpo IgG2a	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, Stati Uniti	Codice: A21131	capra
Supporto di montaggio contenente DAPI	ZSGB-BIO, Pechino, Cina	ZLI-9557
Microscopia confocale a fluorescenza	Leica Microsystems, Wetzlar, Germania	TCS SP8 II
Software Image Pro Plus	Cibernetica dei media, Bethesda, MD, Stati Uniti	Versione 6.0
Otoscopio tascabile diagnostico professionale	Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai, Cina	HS-OT10
Elettrodo ad ago	Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an, Cina	Codice: 1029	20 mm, 28 G
Altoparlante a campo chiuso	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, Stati Uniti	CF1