Questo articolo descrive l'etichettatura di superficie e Ex ovo Coltura tissutale nei primi embrionali di pollo. Tecniche suscettibili di time-lapse in campo chiaro, fluorescenza, e tomografia a coerenza ottica di imaging sono presentati. Etichette superficie inseguimento ad alta risoluzione spazio-temporale consente di grandezze cinematiche quali ceppi morfogenetici (deformazioni) deve essere calcolato in due e tre dimensioni.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Monitoraggio Deformazioni tessuto morfogenetica in embrione di pollo primi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Embrionale epiteli subiscono deformazioni complesse (ad es flessione, torsione, piegatura, e stretching) per formare gli organi primitiva dell'embrione precoce. Monitoraggio marcatori fiduciali sulla superficie di questi fogli cellulare è una consolidata metodo per stimare quantità morfogenetici, come la crescita, la contrazione e taglio. Tuttavia, non tutte le tecniche di etichettatura di superficie sono facilmente adattabili alle modalità di imaging convenzionali e in possesso di diversi vantaggi e limitazioni. Qui, descriviamo due metodi di etichettatura e illustrare l'utilità di ogni tecnica. Nel primo metodo, centinaia di etichette fluorescenti sono applicate simultaneamente per l'embrione utilizzando particelle di ferro magnetico. Queste etichette vengono poi utilizzati per quantità 2-D deformazioni durante la morfogenesi dei tessuti. Nel secondo metodo, microsfere di polistirolo sono utilizzati come agenti di contrasto a non invasiva tomografia a coerenza ottica (OCT) per tenere traccia di imaging 3-D deformazioni del tessuto. Queste tecniche hanno avuto successoLy implementato nel nostro laboratorio per studioIl meccanismi fisici di piegare la testa all'inizio, il cuore, e lo sviluppo del cervello, e dovrebbe essere adattabile ad una vasta processi morfogenetici gamma.
Protocollo
1. Preparazione generale Sperimentale
- Preparare terreno di coltura dei tessuti in cappa a flusso laminare.
- Diluire Media Dulbecco Modified Eagle (DMEM) (1 bottiglia di L con 4,5 g / L glucosio, bicarbonato di sodio, e L-glutamina). Aggiungere 10 ml di penicillina / streptomicina / neomicina antibiotici.
- Togliere 100 ml di DMEM con una pipetta sterile per il trasferimento e sostituire con 100 ml di siero pulcino.
- Aliquota del pulcino DMEM/10% di siero / 1% di antibiotici sterili in 15 flaconcini ml e congelare.
- Preparare tampone fosfato (PBS) integrato con calcio e magnesio. Mescolare 100 ml PBS 10X, 900 ml d....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Due tecniche di etichettatura dei tessuti vengono presentati per la cultura ex ovo di embrioni di pollo precoce. Il primo utilizza coloranti fluorescenti lipofile forniti tramite particelle di ferro magnetico di etichettare simultaneamente centinaia di cellule. Tuttavia, questo metodo non è attualmente compatibile con tomografia a coerenza ottica, come tinture fluorescenti mostrano generalmente poco contrasto da tessuti circostanti con 10 ott. Quindi, ci mostrano una tecnica alternativa utilizzando m.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concede GM075200 R01 e R01 HL083393 (LAT). Riconosciamo il supporto borsa di studio per BAF dal NIH T90 DA022871 Mallinckrodt e l'Istituto di Radiologia, e per VDV da concedere 09PRE2060795 dalla American Heart Association.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Materiale / Reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| DMEM - glucosio | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Penicillina / streptomicina / Neomicina | Sigma-Aldrich | P4083 | |
| Pollo Siero | Invitrogen | 16110-082 | |
| Fosfato Dulbecco Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X |
| Whatman # 2 filtri di carta | Whatman | 1002 090 | Diametro 90mm |
| Vetro Micropipette | Mondo di precisioneStrumenti (WPI) | TW150-6 | 1,5 millimetri di diametro interno |
| Dii | Invitrogen | D-282 | |
| Riduzione di ferro | Mallinckrodt Baker Inc. | 5320 | |
| Diametro 10 micron Microsfere (nero) | Polysciences Inc. | 24294 | |
| Delta T Dish (per la cultura lasso di tempo) | Bioptechs | 04200415B | Di spessore, 0,17 millimetri nero |
| Delta T4 Cultura controller Dish | Bioptechs | 0420-4-03 | |
| Mini-pompa di dispositivo di portata variabile | Fisher Scientific |
Riferimenti
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Canfield, J. G. Dry beveling micropipettes using a computer hard drive. J. Neurosci. Methods. 158, 19-21 (2006).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
