Valutazione delle interazioni tra neuroni glutammatergici e cellule di glioma in una co-coltura

Abstract

Fonte: Fuchs, Q. et. al., Co-coltura di neuroni glutammatergici e cellule di glioma pediatrico di alto grado in dispositivi microfluidici per valutare le interazioni elettriche. J. Vis. Exp. (2021)

Questo video dimostra la valutazione dell'attività elettrica neuronale in una co-coltura di neuroni glutammatergici corticali derivati da hiPSC e cellule di glioma utilizzando un dispositivo microfluidico con array multielettrodi.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Protocollo di co-coltura

1. Regolare il giorno di semina e la concentrazione per le linee cellulari UW479 e BT35 per raggiungere l'80% delle cellule confluenti quando dovrebbe iniziare la co-coltura, corrispondente a 21 giorni di coltura per i neuroni glutammatergici.
2. Tripsinizzare le cellule UW479 e BT35 e seminarle sulla parte superiore dei neuroni glutammatergici in ciascun dispositivo microfluidico dedicato (con una densità target di 900 cellule/mm² per ogni tipo di cellula) prima di seminare le cellule di gliomi pediatrici di alto grado (pHGG) nel dispositivo microfluidico contenente neuroni glutammatergici maturi.
3. Mantenere le co-colture per 2 giorni in un ambiente controllato (37 °C, 5% CO₂) con il neurone glutammatergico Day11 e il terreno successivo descritto nella Tabella 1.
4. Contare le cellule pHGG utilizzando le immagini microscopiche analizzate con il software di analisi delle immagini per valutarne la vitalità. Calcola la percentuale di celle.
   NOTA: Utilizzare la seguente formula: 100 - ((numero di celle in D23 / numero di celle in D21) x 100).

2. Registrazione elettrofisiologica

1. Eseguire la registrazione elettrofisiologica con un sistema commerciale e un software disponibile in commercio.
   nota: Gli esperimenti sono stati condotti con un array multielettrodo (MEA) costituito da elettrodi di 30 μm di diametro distanziati di 100 μm.
2. Eseguire una prima registrazione elettrofisiologica su neuroni glutammatergici a D21 prima della semina delle cellule pHGG. Utilizzare i neuroni glutammatergici differenziati come controllo e coltivarli da soli in parallelo alla co-coltura. Eseguire una seconda registrazione per entrambe le condizioni come descritto nel passaggio successivo numero 3.
3. Eseguire una seconda registrazione elettrofisiologica al D23 (dopo 2 giorni di co-coltura).

Tabella 1: Composizione dei terreni di coltura per neuroni glutammatergici derivati da hiPS.

Componenti	Substrato di semina	D4 medio	D7 medio	D11 e successivi medi
DMEM/F-12 Medio	0,5 volte	0,25 volte	0,125 volte	Ø
Terreno neurobasale	0,5 volte	0,25 volte	0,125 volte	Ø
BrainPhys Medium	Ø	0,5 volte	0,75 volte	1x
Supplemento SM1	1x	1x	1x	1x
Integratore N2-A	1x	1x	1x	1x
Ala-Gln (GlutaMax)	0,5 mM	0,5 mM	0,5 mM	0,5 mM
BDNF	10 ng/mL	10 ng/mL	10 ng/mL	10 ng/mL
GDNF	10 ng/mL	10 ng/mL	10 ng/mL	10 ng/mL
TGF-β1	1 ng/mL	1 ng/mL	1 ng/mL	1 ng/mL
Geltrex	30 μg/mL	Ø	Ø	Ø
Integratore per la semina	1x	Ø	Ø	Ø
Supplemento Giorno 4	Ø	1x	Ø	Ø

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
256MEA100/30iR-ITO-senza	Mcs	256MEA100/30iR-ITO-senza
Sonda da 40 μm per Contatore di scettri	Dutscher	Codice: 53750
Sonda da 60 μm per Contatore Scettro	Dutscher	Codice: 51999
Ala -Gln (GlutaMAX)	sigma	G8541
Cabina di sicurezza biologica di classe II	Termo Scientifico	HERASafe tipo KS12
Neuroni glutammatergici corticali	BrainXell	BX-0300
DMEM/F12 Medio	sigma	D8437
DPBS 1X	Dutscher	L0615-500
Palloni per colture cellulari EasYFlaskTM 75cm3	Nunc	156499
Siero bovino fetale (FBS)	Dutscher	500105
GDNF	Peprotech	450-10
Geltrex	Tecnologie per la vita	A1413201
BDNF umano	Peprotech	450-02
incubatrice	Memmert	IC0150med
MEA2100	Mcs	181205-MEA2100-11240
Micropipetta P10	Sartorius	LH-729020
Micropipetta P100	Sartorius	LH-729050
Micropipetta P1000	Sartorius	LH-729070
Micropipetta P200	Sartorius	LH-729060
Microprovetta Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock	Dutscher	Telefono 33290
Sperimentatore multicanale	Mcs	-
Integratore N2-A	Cellule staminali	Codice: 7152
Terreno neurobasale	Tecnologie per la vita	21103049
Integratore neuronale Neurocult SM1	Cellule staminali	Codice: 5711
Aminoacidi non essenziali (NEAA) senza L-glutammina	Dutscher	X0557-100
Pipeteur Pipet-Aid XP Gravità	Drummond	4000202/4038202
Pipetta per coltura cellulare 10 mL Falcon®	Dutscher	357551
Pipetta per colture cellulari 5 mL Falcon®	Dutscher	357543
Autista di targhe (CultureTemp)	Belart	370151000
Poli-D-lisina	sigma	P6407
Microscopio Primovert	Zeiss	Numero 415510-1100-000