Impianto di un array di elettrodi e di una fibra ottica nell'ippocampo del topo

Abstract

Fonte: Bender, F., et. al., Trascinamento optogenetico delle oscillazioni theta ippocampali nei topi comportanti. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video dimostra l'impianto stereotassico di un array di elettrodi a filo e di una fibra ottica nell'ippocampo di un modello murino.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione delle fibre ottiche (Figura 1A)

1. Utilizzare fibra ottica multimodale (nucleo da 105 μm, rivestito in vetro con nucleo in silice, 0,22 NA). Spellare il rivestimento da 125 μm dell'anima in fibra utilizzando un micro-stripper mentre la fibra è ancora attaccata alla bobina di fibra.
2. Tagliare la fibra a una lunghezza di circa 2-3 cm utilizzando un coltello diamantato.
3. Inserire la fibra in una boccola in ceramica di zirconio (ID: 126 μm). Circa 0,5-1 mm della fibra ottica dovrebbero sporgere dal lato convesso della ghiera.
4. Usando un ago, applica una goccia di colla epossidica su entrambe le estremità della ghiera ma non sui lati della ghiera. In alternativa, usa la super colla.
5. Lasciare asciugare la colla per almeno 30 minuti.
6. Lucidare il lato convesso della ghiera utilizzando una pellicola lucidante in fibra diamantata (grana 3 μm).
7. Testare la fedeltà del trasferimento della luce utilizzando un misuratore di potenza ottica.
   1. Impostare la lunghezza d'onda sul misuratore di potenza sulla stessa lunghezza d'onda del laser in uso.
   2. Posizionare il cavo patch con la punta rivolta verso il centro del sensore. Accendi il laser e leggi l'emissione luminosa dal misuratore di potenza. Registrare il valore.
   3. Collegare la fibra ottica al cavo patch tramite un manicotto di accoppiamento e posizionarla con la punta della fibra rivolta verso il centro del sensore. Accendi il laser e leggi l'emissione luminosa dal misuratore di potenza. Registrare il valore.
   4. Calcola la velocità di trasmissione dividendo il secondo valore per il primo. Se la velocità di trasmissione è inferiore a 0,5, scartare la fibra; In caso contrario, utilizzarlo per l'impianto.
   5. Testare la velocità di trasmissione per ciascuna fibra prima dell'impianto.
   6. Per esperimenti successivi, regolare l'emissione dell'intensità luminosa del laser in base alla velocità di trasmissione della fibra ottica: impostare l'emissione di luce dalla punta del cavo patch su 5-15 divisa per la velocità di trasmissione per ottenere un'emissione di luce finale dalla punta della fibra di 5-15 mW.

2. Preparazione di array di fili di tungsteno per registrazioni LFP (Figura 1B)

1. Incollare diverse (ad esempio 6) guide per tubi di silice da 100 μm in parallelo al lato adesivo di un pezzo di nastro. Tagliare un pezzo, circa 4-6 mm, per un assemblaggio di array di fili.
2. Infilare fili di tungsteno da 45 μm isolati in forma attraverso i tubi guida utilizzando una pinza.
3. Spellare sei fili di rame sottili isolati in smalto (lunghi circa 5 mm) e un filo di messa a terra (lungo circa 2-3 cm) utilizzando un bisturi per raschiare via l'isolamento su entrambe le estremità. Saldarli ai pin del nanoconnettore.
4. Collegare ciascun filo di collegamento a un filo di tungsteno utilizzando rispettivamente una goccia di vernice conduttiva all'argento. Lasciare asciugare per almeno 30 min.
5. Applicare una quantità minima di cemento per coprire i fili. Non applicare cemento sui fili di tungsteno, che verranno inseriti nel tessuto cerebrale, o sulla parte superiore del nano connettore. Lasciare asciugare il cemento per almeno 30 minuti.
6. Eseguire un taglio angolare (5-20°) dei fili di tungsteno utilizzando forbici smussate in acciaio inossidabile per consentire un impianto affidabile di fili al di sotto o al di sopra della zona ventralmente adiacente allo strato piramidale, dove l'ampiezza theta è troppo bassa per stimare la fedeltà del trascinamento.
7. Deisolare la punta (circa 2 mm) del filo di terra utilizzando un bisturi per raschiare via l'isolamento. Trattarlo con flusso e pre-saldatura.
8. Controllare le potenziali diafonie tra gli elettrodi utilizzando un multimetro digitale. Collegare i pin del connettore al multimetro, che deve essere impostato sulla modalità di misurazione della resistenza. Controllare le combinazioni di canali a coppie; una lettura sul multimetro inferiore a 5 MΩ indica una diafonia significativa.
9. Utilizzare un impedenziometro per controllare l'impedenza di ciascun elettrodo a filo in soluzione fisiologica. I valori tipici di impedenza sono inferiori a 100 kΩ.
10. Per facilitare l'impianto, incollare una fibra ottica all'array di fili in modo che la punta della fibra sia al livello del filo più corto e la punta della fibra sia in prossimità ma non tocchi i fili di tungsteno. Mantenere l'angolo della fibra il più piccolo possibile per evitare danni ai tessuti durante l'impianto.

3. Impianti stereotassici

1. Rimuovere il tessuto connettivo dalla parte superiore del cranio e spingere accuratamente verso il basso i muscoli del collo di circa 2 mm per evitare artefatti muscolari durante la registrazione.
2. Pulire il cranio utilizzando un applicatore a punta di cotone e soluzione fisiologica e praticare quattro fori (2 nella parte anteriore e due sopra il cervelletto, diametro 0,8 mm) per posizionare le viti ossee in acciaio inossidabile (00-96x1/16) per la rettifica e la stabilizzazione dell'impianto (Figura 1D). Posizionare la vite di massa, collegata a un filo di rame (circa 2-3 cm di lunghezza) sopra il cervelletto.
3. Coprire completamente la vite di messa a terra con cemento per evitare artefatti muscolari durante le registrazioni elettrofisiologiche. Costruire un anello di cemento che colleghi tutte le viti (Figura 1E).
4. Eseguire una craniotomia sopra il lato dell'impianto (Ippocampo, AP -1,94, L 1,4, V 1,4 in riferimento al bregma). Applicare circa 5 μL di NaCl sterile sulla superficie del tessuto cerebrale.
5. Abbassare lentamente l'array di fili usando la stereotassi nella craniotomia. Per le registrazioni unitarie, impiantare una sonda in silicone invece di un array di fili. Per evitare artefatti da luce optoelettrica, impiantare la fibra ottica separatamente nell'ippocampo con la punta della fibra non rivolta direttamente verso la sonda (Figura 1C—I). Per studiare la coordinazione del trascinamento tra gli emisferi, impiantare una fibra ottica aggiuntiva nell'area CA1 dell'ippocampo controlaterale.
6. Per proteggere il tessuto cerebrale, applicare circa 5 μl di cera liquida/olio di paraffina caldo, preriscaldato a 70 °C, con una siringa sopra il sito di impianto.
7. Applicare il cemento attorno alla matrice di fili e coprire il cranio con cemento.
8. Applicare una goccia di flusso al filo di terra/riferimento pre-saldato e al filo pre-saldato collegato alla vite di messa a terra utilizzando, ad esempio, un ago, e fondere i fili utilizzando una saldatrice.
9. Coprire l'intero filo di terra con cemento.
10. Somministrare 0,3 ml di ericino (1:4 in NaCl sterile) e carprofene (5 mg/mL) i.p. dopo l'intervento chirurgico e per almeno i due giorni successivi. Il topo in genere si sveglia entro 15 minuti dall'intervento chirurgico. Riscalda l'animale con una lampada rossa per accelerare il recupero.
11. Monitorare il peso del topo ogni giorno per la prima settimana dopo l'intervento chirurgico o fino a quando non è stabile. La perdita di peso non deve superare il 10% del peso registrato del topo prima dell'intervento chirurgico. Per accelerare la stabilizzazione del peso, fornire al topo cibo umido e latte condensato durante i primi giorni dopo l'intervento.
12. Per registrare l'attività cellulare dell'ippocampo durante il trascinamento, impiantare una sonda in silicone nell'ippocampo (AP -1,94, L 1,4, V 1, con successivo abbassamento) (Figura 1C—I). Impiantare la fibra ottica nell'ippocampo ad AP -3, L 1.4, V 1.6, 39° caudale-rostrale. Se si desidera la stimolazione dei somati cellulari, impiantare una fibra ottica aggiuntiva nella SM (AP +0,98, L 1, V 3,9, 15° laterale).

Results

Figura 1: Illustrazione di fibre ottiche, elettrodi e chirurgia. (A) Illustrazione di una fibra ottica. (B) Illustrazione di un array di fili incollato a una fibra ottica per la registrazione della LFP ippocampale durante il trascinamento delle oscillazioni theta dell'ippocampo. (C) Per la registrazione dell'attività cellulare dell'ippocampo, una son...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse PV-Cre	Il laboratorio Jackson	B6; 129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J
Stereotassi	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, Stati Uniti	Modello 963	Strumento stereotassico ultra preciso per piccoli animali
Punte da trapano, 0,8 mm	Bijoutil, Allschwil, Svizzera	49080HM
Stazione di saldatura	Weller Tools GmbH, Besigheim, Germania	WSD 81
eritromicina	Rotexmedica GmbH, Trittau, Germania	PZN: 10823932	1 g di polvere per soluzione per infusione
Trapano/smerigliatrice di precisione	Proxxon, Wecker, Lussemburgo	FBS 240/E
Fibra ottica multimodale	ThorLabs, Dachau, Germania	FG105LCA	0,22 NA, Low-OH, Nucleo Ø105 μm, 400 - 2400 nm
Ghiera in ceramica	Prodotti in fibra di precisione, Milpitas, CA, Stati Uniti	CFLC126	Ferrula in ceramica LC MM, ID 126um
Carta lucidante	Thorlabs	LF3D	6 "x 6" Foglio di lappatura diamantata (lucidatura)
Misuratore di potenza	Thorlabs	PM100D	Console compatta per contatori di potenza ed energia, LCD digitale da 4"
Accoppiatore multimodale in fibra ottica	Thorlabs	FCMM50-50A-FC	Accoppiatore 1x2 mm, rapporto di divisione 50:50, fibre GI 50 μm, FC/PC
Cavo patch in fibra ottica	Thorlabs	FG105LCA PERSONALIZZATO-MUC	su misura, lunghezza 3 m, con tubo di protezione, Tubo: FT030, Connettore 1: FC/PC, Connettore 2: ghiera in ceramica da 1,25 mm (LC)
manica	Prodotti in fibra di precisione, Milpitas, CA, Stati Uniti	ADAL1	Manicotto di accoppiamento diviso in ceramica per boccole Ø1,25 mm (LC/PC)
Fili di tungsteno	California Fine Wire Company, Grover Beach, CA, Stati Uniti	CFW0010954	40 μm, 99,95%
Tubi capillari	Optronica	1068150020	ID: 100,4 μm
Nanoconnettore Omnetics	Omnetics Connector Corporation, Minneapolis, Stati Uniti	Codice A79038-001
viteria	Bilaney, Düsseldorf, Germania	00-96x1/16	in acciaio inossidabile
Vernice conduttiva argento	Conrad electronics, Germania	530042
Flusso di liquidi	Felder GMBH Löttechnik, Oberhausen, Germania	Lötöl ST	DIN EN 29454.1, 3.2.2.A (F-SW 11)