Controllo optogenetico della dinamica della rete ippocampale

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Controllo optogenetico nell'ippocampo isolato
   NOTA: Per il controllo optogenetico dell'attività della rete ippocampale, viene utilizzata una strategia specifica per tipo di cellula che coinvolge l'attivazione ritmica di cellule GABAergiche contenenti PV (parvalbumina positiva), poiché queste cellule hanno dimostrato di svolgere un ruolo importante nella sincronizzazione delle principali popolazioni cellulari nell'ippocampo isolato. L'espressione selettiva del canale eccitatorio rodopsina-2 (ChR2) nelle cellule PV si ottiene incrociando la linea murina PV-Cre con topi che esprimono costitutivamente ChR2 Cre-dipendente (Ai32), generando così topi PV-ChY. In alternativa, i costrutti di vettori virali (ad esempio, AAVdj-ChETA-eYFP) possono essere iniettati nell'ippocampo di topi PV-Cre o PV-TOM (P15-16) per guidare l'espressione dell'opsina eccitatoria negli interneuroni CA1/SUB (Figura 1A).
   1. Posizionare un elettrodo LFP nell'area CA1/SUB (Cornu ammonis-1/subiculum) e applicare un cerotto a una cellula piramidale vicina nell'ippocampo isolato di un topo che esprime l'opsina eccitatoria ChR2 sensibile alla luce blu negli interneuroni PV.
   2. Posizionare una guida di luce in fibra ottica (0,2 - 1 mm di diametro) sopra la preparazione ippocampale e centrarla sulla regione registrata. Utilizzare la luce blu (473 nm) proveniente da una sorgente LED per la stimolazione optogenetica, costituita da impulsi luminosi (10 - 20 ms, attivati da un segnale logico transistor-transistor) o comandi di tensione sinusoidale erogati a frequenze theta (4 - 12 Hz).
   3. Passa alla pinza amperometrica e caratterizza l'attività della piramide durante le oscillazioni theta spontanee.
   4. Avviare il protocollo di stimolazione e registrare le risposte alla luce. Si osservi che le oscillazioni di campo e l'attività sinaptica nel neurone registrato diventano sempre più sincronizzate durante la stimolazione optogenetica e che la stimolazione ritmica delle cellule PV si traduce in un robusto controllo sia della frequenza che della potenza delle oscillazioni theta (Figura 1).

Figura 1: Potenziale di campo locale e registrazioni simultanee di patch clamp da singoli neuroni piramidali CA1/SUB e PV durante oscillazioni theta spontanee e optogeneticamente guidate nell'ippocampo isolato.

(a) Diagramma che mostra i siti di registrazione dell'elettrodo LFP e patch con il posizionamento della guida della fibra luminosa sopra la regione CA1/SUB che esprime un'opsina sensibile alla luce blu (ChETA accoppiato con il fluoroforo eYFP). (b) Caratterizzazione di un neurone piramidale che mostra le tipiche proprietà di Regular-Spiking (RS) (in alto) e l'immagine ad alto ingrandimento (40X) della cellula registrata (in basso). (c) Registrazione del campione di current-clamp della stessa cella al potenziale di membrana depolarizzato (nero) insieme al segnale LFP (grigio) e che mostra IPSP ritmici sincronizzati durante l'oscillazione spontanea (a sinistra) e durante la stimolazione alla luce a frequenza theta (6 Hz) (a destra). Il modello di stimolazione della luce (ombreggiatura blu) è raffigurato sopra le tracce di tensione. (d) Spettrogramma e spettri di potenza della forma d'onda LFP prima, durante e dopo una stimolazione luminosa a 6 Hz (basale, stim, post). (e) Immagini in campo chiaro e a fluorescenza a basso ingrandimento della preparazione ippocampale isolata che mostrano la fluorescenza eYFP (in verde) localizzata nella regione CA1/SUB. (f) Caratterizzazione delle fasi correnti che mostra il comportamento Fast-Spiking (FS) di un interneurone PV-TOM registrato (immagine a fluorescenza 40X sotto). (g) Registrazione del potenziale di membrana che mostra grandi EPSP e l'accensione ritmica della cella PV registrata sincronizzata con il segnale LFP durante l'oscillazione di campo spontaneo (a sinistra) e durante la stimolazione luminosa (a destra) a 3 Hz. (h) Media attivata dal campo (FTA) dei picchi della cella PV sul segnale CA1/SUB LFP. La scarica della cella fotovoltaica in più prove (centrate sui picchi LFP) è stata convertita in un FTA di picchi registrati durante l'oscillazione spontanea (basale) e durante la stimolazione luminosa (stim). I grafici centrale e inferiore mostrano i grafici raster dei picchi e gli istogrammi di probabilità dei picchi (la probabilità media è mostrata in rosso). I grafici più in alto mostrano i grafici del segnale LFP medio, che è aumentato di potenza durante la stimolazione luminosa in parallelo con l'accensione altamente sincronizzata della cella fotovoltaica ad aggancio di fase al picco dell'oscillazione LFP.