Controllo optogenetico della dinamica della rete ippocampale

Abstract

Fonte: Manseau, F., et al. Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Metodologie per la Registrazione dal Circuito Setteippocampale Isolato per Roditori. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video dimostra il metodo per utilizzare l'optogenetica per modulare la dinamica della rete ippocampale attivando interneuroni sensibili alla luce geneticamente modificati in una fetta di cervello di topo, migliorando la sincronizzazione dell'oscillazione theta e studiando il comportamento dei circuiti neurali.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Controllo optogenetico nell'ippocampo isolato
   NOTA: Per il controllo optogenetico dell'attività della rete ippocampale, viene utilizzata una strategia specifica per tipo di cellula che coinvolge l'attivazione ritmica di cellule GABAergiche contenenti PV (parvalbumina positiva), poiché queste cellule hanno dimostrato di svolgere un ruolo importante nella sincronizzazione delle principali popolazioni cellulari nell'ippocampo isolato. L'espressione selettiva del canale eccitatorio rodopsina-2 (ChR2) nelle cellule PV si ottiene incrociando la linea murina PV-Cre con topi che esprimono costitutivamente ChR2 Cre-dipendente (Ai32), generando così topi PV-ChY. In alternativa, i costrutti di vettori virali (ad esempio, AAVdj-ChETA-eYFP) possono essere iniettati nell'ippocampo di topi PV-Cre o PV-TOM (P15-16) per guidare l'espressione dell'opsina eccitatoria negli interneuroni CA1/SUB (Figura 1A).
   1. Posizionare un elettrodo LFP nell'area CA1/SUB (Cornu ammonis-1/subiculum) e applicare un cerotto a una cellula piramidale vicina nell'ippocampo isolato di un topo che esprime l'opsina eccitatoria ChR2 sensibile alla luce blu negli interneuroni PV.
   2. Posizionare una guida di luce in fibra ottica (0,2 - 1 mm di diametro) sopra la preparazione ippocampale e centrarla sulla regione registrata. Utilizzare la luce blu (473 nm) proveniente da una sorgente LED per la stimolazione optogenetica, costituita da impulsi luminosi (10 - 20 ms, attivati da un segnale logico transistor-transistor) o comandi di tensione sinusoidale erogati a frequenze theta (4 - 12 Hz).
   3. Passa alla pinza amperometrica e caratterizza l'attività della piramide durante le oscillazioni theta spontanee.
   4. Avviare il protocollo di stimolazione e registrare le risposte alla luce. Si osservi che le oscillazioni di campo e l'attività sinaptica nel neurone registrato diventano sempre più sincronizzate durante la stimolazione optogenetica e che la stimolazione ritmica delle cellule PV si traduce in un robusto controllo sia della frequenza che della potenza delle oscillazioni theta (Figura 1).

Risultati

Figura 1: Potenziale di campo locale e registrazioni simultanee di patch clamp da singoli neuroni piramidali CA1/SUB e PV durante oscillazioni theta spontanee e optogeneticamente guidate nell'ippocampo isolato.

(a) Diagramma che mostra i siti di registrazione dell'elettrodo LFP e patch con il posizionamento della guida della fibra luminosa sopra la regione...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagenti
cloruro di sodio	Sigma Aldrich	S9625
saccarosio	Sigma Aldrich	S9378
bicarbonato di sodio	Sigma Aldrich	Episodio 5761
NaH2PO4 - sodio fosfato monobasico	Sigma Aldrich	S8282
Solfato di magnesio	Sigma Aldrich	Visualizzazione del materiale M7506
cloruro di potassio	Sigma Aldrich	P3911
D-(+)-glucosio	Sigma Aldrich	G7528
Cloruro di calcio diidrato	Sigma Aldrich	C5080
Ascorbato di sodio	Sigma Aldrich	Codice A7631-25G
attrezzatura
Miscela di gas 95% O2/5% CO2 (carbogeno)	Vitalaire	SG466204A	sistema di perfusione
Bottiglie/fiaschi di vetro (4 x 1 L)	n.d.	n.d.	sistema di perfusione
Camera di registrazione sommersa	design personalizzato (FM)	n.d.	Può essere utilizzata un'alternativa commerciale
Amplificatore patch-clamp Multiclamp 700B	Dispositivi molecolari	MULTICLAMP	elettrofisiologia
Programma Multiclamp 700B Commander	Dispositivi molecolari	MULTICLAMP	elettrofisiologia
Convertitore digitale/analogico	Dispositivi molecolari	DDI440	elettrofisiologia
Micromanipolatori (ad azionamento manuale)	Siskiyou	MX130	elettrofisiologia (LFP)
Micromanipolatori (automatizzati)	Siskiyou	MC1000e	Elettrofisiologia (cerotto)
Monitor audio	Sistemi A-M	Modello 3300	elettrofisiologia
Microscopio a fluorescenza verticale su misura	Siskiyou	n.d.	Imaging
Videocamera analogica	COHU	4912-2000/0000	Imaging
Cattura fotogrammi digitale con software di imaging	EPIX, Inc	PIXCI-SV7	Imaging
Obiettivo Olympus 2.5x	Olimpo	MPLFLN	Imaging
Obiettivo ad immersione in acqua Olympus 40x	Olimpo	UIS2 LUMPLFLN	Imaging
Sistema a diodi emettitori di luce (LED) su misura	costume	n.d.	stimolazione optogenetica (Amhilon et al., 2015)
animali
PV::Cre (KI) mouse	Laboratorio Jackson	Codice 008069	Consentire l'espressione genica diretta da Cre negli interneuroni PV
Topi Ai9 costitutivo-condizionali (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI))	Laboratorio Jackson	Codice 007905	Express TdTomato a seguito di ricombinazione mediata da Cre
Topi Ai32 (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP	Laboratorio Jackson	Numero di 012569	Esprimere la proteina di fusione canalerodopsina-2/EYFP migliorata in seguito all'esposizione alla Cre ricombinasi
Topi in PVChY	Allevamento in casa	n.d.	Prole ottenuta dall'incrocio della linea PV-Cre con topi Ai32 (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP