Valutazione di una giunzione neuromuscolare funzionale tramite stimolazione ottica simultanea e registrazione video

Abstract

Fonte: Liberman, M., et al., Ingegneria e caratterizzazione di un modello optogenetico della giunzione neuromuscolare umana. (2022).

Questo video mostra un metodo per valutare le giunzioni neuromuscolari funzionali. Utilizzando un bioreattore contenente tessuto muscolare e motoneuroni, insieme alla microscopia a fluorescenza, i canali sensibili alla luce nei neuroni vengono stimolati per generare segnali elettrici, causando contrazioni delle fibre muscolari.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Preparazione del bioreattore

1. Realizzare stampi per bioreattori
   1. Scarica un file CAD (Computer-aided design) del bioreattore dal file CAD supplementare o crea un progetto personalizzato.
   2. Genera un percorso utensile CNC (Computer Numerical Control) dal modello 3D utilizzando il software CAM (Computer-aided manufacturing).
   3. Lavora stampi in acetale utilizzando una fresatrice CNC.
2. Fabbricazione di bioreattori
   1. Miscelare una miscela 10:1 di polidimetilsilossano (PDMS, 77 g di miscela per 4 piattaforme/stampi).
   2. Mettere la miscela in una camera a vuoto, chiudere tutte le valvole, accendere il vuoto e degassare la miscela per almeno 30 minuti fino a quando non rimangono bolle d'aria. Versare il composto negli stampini e degassare gli stampini nella camera a vuoto per 1 h.
   3. Chiudere gli stampi con la metà superiore dello stampo nell'orientamento corretto. Posizionare un'asta esagonale in acciaio al centro e bloccarla su entrambi i lati.
   4. Riempire nuovamente la parte superiore con PDMS.
   5. Polimerizzare gli stampini in forno a 65 °C per almeno 4 h.
   6. Rimuovere le piattaforme dagli stampi dopo averle raffreddate a temperatura ambiente.
   7. Pulire i dispositivi in un bagno a ultrasuoni utilizzando cicli di 1 ora di detersivo per piatti, 400 ml di isopropanolo al 100% e acqua distillata.
   8. Asciugare per una notte a 65 °C.
   9. Immergere i vetrini coprioggetti in un tensioattivo non ionico all'1% di poliolo per 30 minuti, assicurandosi che non si accumulino in modo che siano tutti adeguatamente rivestiti.
   10. Sciacquare bene con acqua distillata e asciugare per una notte a 65 °C.
   11. Trattare i vetrini coprioggetti e la piattaforma PDMS con un pulitore al plasma ad alta velocità con 6 L/min di ossigeno per 1-2 minuti. Una volta trattati, incollare i due insieme premendo il PDMS sul vetrino coprioggetti per almeno 30 s.
   12. Autoclavare i dispositivi incollati prima di aggiungere le celle.

2. Costruire una configurazione di stimolazione ottica

1. Utilizzando un sistema a cubo a gabbia da 30 mm, fissare al centro uno specchio dicroico da 573 nm. Accoppia un LED rosso da 627 nm (Light Emitting Diode) con un filtro di eccitazione passa-lungo da 594 nm e fissalo al lato superiore del cubo, con il LED rivolto verso lo specchio. Quindi collegare un LED blu da 488 nm con un filtro di eccitazione passa-corto da 546 nm al lato adiacente del cubo, con il LED rivolto verso lo specchio come mostrato nello schema nella Figura 1A.
2. Collegare un diaframma a iride azionato ad anello alla parte inferiore del cubo della gabbia per controllare le dimensioni dell'area illuminata.
3. Alimenta ogni LED con un driver LED T-Cube e controllalo tramite una scheda Arduino Uno Rev3. Collegare l'ingresso laterale del driver LED a una spina di alimentazione, collegare l'uscita centrale ad Arduino e collegare l'uscita laterale direttamente ai LED.
4. Collega Arduino Uno a un computer con un cavo USB.
5. Scarica i file dal collegamento GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).
6. Apri il file "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" dalla cartella GitHub.
7. Imposta i parametri iniziali: Passi = 30; startFrequency = 0,5; endFrequency = 3; pulseLength = 100.
8. Assicurarsi che l'uscita pin 4 sia assegnata al driver LED blu e che l'uscita pin 2 sia assegnata al driver LED rosso. Verificare che i fili centrali del driver LED siano collegati a terra e alla rispettiva uscita pin.
9. Compila e carica il programma "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" su Arduino.
10. Collegare ciascun driver LED al canale corrispondente.

3. Configurazione della coltura cellulare (giorno -21-0)

1. Cellule muscolari scheletriche primarie
   1. Scongelare ed espandere i mioblasti scheletrici primari (ottenuti da Cook Myosite) per un massimo di sei passaggi utilizzando il terreno di crescita miotonico (+ integratore). Mantenere le cellule in un incubatore impostato a 37 °C e 5% di CO₂.
   2. Cambia il supporto ogni 2 giorni.
   3. Una volta che le cellule sono confluenti per circa il 60%, passarle utilizzando tripsina-EDTA allo 0,05% (1x, per 5 minuti a 37 °C). Raccogliere le cellule dissociate e aggiungere nuovi terreni per neutralizzare la tripsina.
   4. Centrifugare le celle a 300 x g e aspirare il surnatante sopra il pellet cellulare.
   5. Risospendere le cellule con MGM e seminare 1:3 con 60 mL per pallone a triplo strato.
2. ChR2-hiPSC
   nota: Tutte le linee cellulari per questo lavoro sono state create e utilizzate in conformità con le linee guida istituzionali della Columbia University, NY, USA. In questo protocollo, le hiPSC che esprimono ChR2 sono state generate tramite l'editing del genoma CRISPR-Cas9 utilizzando metodi precedentemente descritti18, ma qualsiasi linea cellulare optogenetica stabile (lentivirale, piggyBac, ecc.) può essere utilizzata allo stesso modo. Sono stati scelti promotori costitutivi espressi sia nelle iPSC che nei motoneuroni (CAG). Si è scoperto che le cellule avevano cariotipi sani, come notato in precedenti pubblicazioni.
   1. Rivestire le piastre a 6 pozzetti con 1 mL/pozzetto di matrice di membrana basamentale solubilizzata diluita in DMEM/F12 (1:80) e incubare le piastre a temperatura ambiente per 1 ora.
   2. Seminare iPSC su piastre rivestite a 6 pozzetti con 2 mL di terreno di coltura cellulare senza feeder (terreni iPSC), scambiando 2 mL di terreno a giorni alterni e passandole ogni 5-7 giorni. Mantenere le cellule in un incubatore impostato a 37°C e 5% di CO₂.
   3. Passaggio
      1. Dissociare le cellule staminali incubandole con 1 mL di reagente per il rilascio di cellule staminali privo di enzimi per 4 minuti e tagliandole meccanicamente con una pipetta P1000 a punta larga.
      2. Cellule di semina con un rapporto di 1:24 o 1:48 in terreno iPSC con 2 μM di dicloridrato di Y-27632 in 2 mL/pozzetto su piastre rivestite a 6 pozzetti.

4. Inseminazione del tessuto muscolare scheletrico (giorno -3)

1. Isolare e contare 30 x 106 mioblasti utilizzando un contatore di cellule automatizzato.
2. Risospendere i mioblasti in una miscela 4:1 di 3 mg/mL di collagene I e matrice di membrana basale solubilizzata (800 μL di miscela di collagene + 200 μL di matrice di membrana basale per raggiungere un volume finale di 1 mL). Per il componente di collagene, aggiungere l'agente neutralizzante di accompagnamento (miscela 9:1 di collagene con agente neutralizzante) e diluire la miscela con 1x PBS per ottenere un volume di 800 μL.
3. Aggiungere 15 μl di sospensione di collagene cellulare a ciascuna camera muscolare del bioreattore, assicurandosi di distribuire la sospensione su entrambi i pilastri utilizzando la punta della pipetta (Figura 2).
4. Lasciare polimerizzare la miscela cellula-gel a 37 °C per 30 minuti, quindi riempire ogni pozzetto del bioreattore con 450 μL di terreno di crescita miotonico.
5. Dopo 3 giorni (una volta che il gel si è compattato), iniziare la differenziazione del miotubo.

5. Differenziazione del miotubo (giorni 0-14)

1. Iniziare l'infusione del miotubo commutando i tessuti a 450 μL di terreno che induce la fusione (FS, Tabella 1) per 7 giorni, cambiando il terreno a giorni alterni.
   nota: Provare a iniziare la differenziazione dei miotubi lo stesso giorno della differenziazione dei motoneuroni dalle hiPSC per seminare i motoneuroni alla fine dei programmi di differenziazione di entrambi i tipi di cellule.
2. Il giorno 7 cambiare il terreno a 450 μL di terreno di maturazione Ia (MMIa, Tabella 1).
3. Il giorno 9, passare a 450 μL di terreno di maturazione Ib (MMIb, Tabella 1).
4. L'11° giorno, cambiare il terreno con 450 μL di NbActiv4. Continua a cambiare il terreno ogni 2 giorni fino a quando i motoneuroni non vengono seminati (Passaggio 7).

6. Differenziazione dei motoneuroni (giorni 0-14)

1. Il giorno 0, trasferire 4 x 10⁶ ChR2- hiPSC in una piastra di Petri a bassissimo attacco con 15 mL di terreno di coltura in sospensione di motoneuroni (MSCM, Tabella 1). Integrare l'MSCM con 3 μM di CHIR99021, 0,2 μM di LDN193189, 40 μM di SB431542 idrato e 5 μM di dicloridrato di Y-27632.
2. Il giorno 2, isolare le neurosfere (NS) con un colino reversibile da 37 μM e riplaccare in 15 mL di MSCM con 3 μM di CHIR99021, 0,2 μM di LDN193189, 40 μM SB431542 idrato e 0,1 μM di acido retinoico. Dopo il 2° giorno, la NS dovrebbe essere visibile nella capsula di Petri senza l'uso di un microscopio.
3. Il giorno 4, trasferire le cellule e i terreni in una provetta da 50 ml e lasciare che le neurosfere si depositino sul fondo (5 min). Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 15 mL di MSCM integrati con 0,5 μM di SAG, 0,2 μM di LDN193189, 40 μM di SB431541 e 0,1 μM di acido retinoico.
4. Il giorno 7, ripetere il passaggio 6.3 ma risospendere le cellule in 15 mL di MSCM integrati con 0,5 μM SAG e 0,1 μM di acido retinoico.
5. Il giorno 9, ripetere il passaggio 6.3 ma risospendere le cellule in 15 mL di MSCM integrati con 10 μM di DAPT.
6. Il giorno 11, ripetere il passaggio 6.3 ma risospendere le cellule in 15 mL di MSCM integrati con 20 ng/mL di BDNF e 10 ng/mL di GDNF.
7. Il giorno 14, semina i motoneuroni nella piattaforma.

7. Semina di aggregati di motoneuroni nel bioreattore (giorno 14)

1. Preparare una miscela di gel 4:1 di 2 mg/mL di collagene I e Matrigel (800 μL di miscela di collagene + 200 μL di Matrigel per raggiungere un volume finale di 1 mL). Per il componente di collagene, aggiungere l'agente neutralizzante di accompagnamento (miscela 9:1 di collagene con agente neutralizzante) e diluire la miscela con 1x PBS per ottenere un volume finale di 800 μL.
2. Utilizzare un colino cellulare da 400 nm per selezionare grandi neurosfere e risospenderle nella miscela di gel.
3. Aspirare il terreno dal serbatoio e con cautela dal pozzetto della neurosfera (Figura 2).
4. Aggiungere 15 μl di miscela di gel nel canale della neurosfera.
5. Caricare una pipetta da 10 μl con 10 μl di gel e quindi prelevare una neurosfera.
6. Depositare l'NS nel canale della neurosfera e assicurarsi che l'NS sia nella camera. Sollevare lentamente la pipetta rilasciando il gel rimanente una volta depositato l'NS. Se non si è sicuri che l'NS sia stato depositato correttamente, controllare la sua posizione utilizzando un microscopio.
7. Lasciare polimerizzare il gel per 30 minuti a 37 °C.
8. Ai serbatoi, aggiungere 450 μL di NbActiv4 integrati con 20 ng/mL di BDNF e 10 ng/mL di GDNF.
9. Cambiare il terreno a giorni alterni per consentire la crescita assonale dal NS al tessuto muscolare.

8. Stimolazione ottica simultanea e registrazione video della funzione NMJ (giorno 24+)

1. Per l'imaging, utilizzare un microscopio a fluorescenza invertita con una fotocamera scientifica a semiconduttore di ossido di metallo complementare (sCMOS).
2. Impostare il binning del software della fotocamera su 2x2, l'esposizione a 20 ms, l'otturatore lineare ON, la velocità di lettura a 540 MHz, la gamma dinamica: 12 bit e guadagno 1 e la modalità sensore: sovrapposizione.
3. Utilizzare l'obiettivo 2x sul microscopio per visualizzare i microtessuti.
4. Collegare una camera di cellule vive (37 °C, 5% CO₂) al tavolino del microscopio.
5. Selezionare la regione di interesse (ROI) che contiene il tessuto dei tessuti scheletrici innervati per ridurre al minimo le dimensioni del file e il tempo di elaborazione.
6. Posizionare un filtro di emissione passa-lungo da 594 nm tra il campione e l'obiettivo di imaging per filtrare gli impulsi di luce blu dalla fotocamera.
7. Posizionare una piastra rettangolare a 4 pozzetti contenente 4 bioreattori (24 tessuti) nella camera delle cellule vive.
8. Fare clic su Live View . Centra e metti a fuoco l'immagine con il ROI desiderato.
9. Carica il codice macro personalizzato dalla cartella GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) per controllare la posizione del palco, la scheda Arduino e l'acquisizione video.
10. Imposta il filmato di output come day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.
11. Esegui il codice macro con le coordinate X,Y desiderate impostate sul palco e acquisisci un time lapse veloce con 1700 fotogrammi a 50 fotogrammi/s.
12. Sostituire il terreno dopo l'imaging e rimettere i campioni nell'incubatore. Attendere almeno 24 ore tra le sessioni di acquisizione delle immagini per evitare l'affaticamento dei tessuti.

Risultati

Figura 1. Stimolazione, registrazione e analisi della funzione NMJ. (A) Schema della configurazione dei LED e del percorso luminoso. (B) Configurazione ottica con microscopio invertito, camera a cellule vive, tavolino automatizzato e telecamera sCMOS. (C) Algoritmo per l'elaborazione batch di video di stimolazione ottica di colture NMJ. (D

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
cellule
SkMDC	Cuocere Myosite	P01059-14M
Media e Supplementi
DMEM/F12 avanzato	ThermoFisher Scientifico	Codice 12634-020
Siero bovino Soluzione di albumina	Millipore Sigma	A9576-50ML
Supplemento G-5 (100X)	ThermoFisher Scientifico	Codice 17503-012
Antibiotico selettivo Geneticin (G418 solfato) (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientifico	Codice 10131-035
Insulina, Umana Ricombinante	Millipore Sigma	91077C-100MG
Matrigel	Corning	354277
mTeSR Plus	Tecnologie delle cellule staminali	Codice 100-0276
Kit di terreni di coltura MyoTonic	Cuocere Myosite	MK-4444
Supplemento N-2	ThermoFisher Scientifico	Codice 17502-048
NBactiv4 500 ml	BrainBits LLC	Cb4-500
Terreno neurobasale	ThermoFisher Scientifico	Codice 21103-049
Neurobasal-A Medium	ThermoFisher Scientifico	Codice A13710-01
Pluronico F-127	Sigma Aldrich	P2443
ReLeSR	Tecnologie delle cellule staminali	Codice: 5872
Articoli in plastica
Sistema a cubo a gabbia da 30 mm	ThorLabs	CM1-DCH, CP33, ER1-P4 e ER2-P4
Filtro reversibile da 37 μm, grande	Tecnologie delle cellule staminali	Codice 27250
Filtro di eccitazione passa-corto da 546 nm	Semrock	FF01-546/SP-25
Specchio dicroico da 573 nm	Semrock	FF573-DI01–25x36
Filtro delle emissioni passa-lungo da 594 nm	Semrock	BLP01-594R-25
Filtro di eccitazione passa-lungo da 594 nm	Semrock	BLP01-594R-25
LED Rebel blu (470nm) su base quadrata SinkPAD-II 10mm - 65 lm @ 700mA	LuxeonStarLED	SP-05-B4
Ottica Carclo 29,8° satinata a fascio circolare da 10 mm - Gambe integrate	LuxeonStarLED	Codice 10413
Piatto di coltura Corning da 60 mm con attacco ultrabasso	Corning	Telefono 3261
dissipatore	LuxeonStarLED	LPD-19-10B
ottica
pluriFiltro 400 μm, confezione da 25, sterile	PluriSelect	43-50400-03
pluriFiltro 500 μm, confezione da 25, sterile	PluriSelect	Codice 43-50500-03
LED Rebel rosso (627nm) su base quadrata SinkPAD-II 10mm - 65 lm @ 700mA	LuxeonStarLED	SP-05-R5
diaframma a iride ad anello	ThorLabs	SM1D12D
Driver LED T-Cube	ThorLabs	LEDD1B, KPS101
Stampi
Distanziatori esagonali filettati femmina, 3 1/2" 10-32, parzialmente filettati 1/2"	Mcmaster	Codice 91920A046
morsetto a C a basso profilo	Mcmaster	Codice 1705A12
Fattori di crescita
Adenosina 3′,5′-monofosfato ciclico	Millipore Sigma	A9501-1G
CHIR 99021, 10 mg compresse rivestite	Tocris	4423-10
DAPT 10 mg	Sistemi di ricerca e sviluppo	Codice 2634-10
CNTF umano, grado di ricerca, 5 μg	Miltenyl Biotec	130-096-336
Proteina Vitronectina Umana, FC	Sistemi di ricerca e sviluppo	2349-VN-100
Proteina Vitronectina Umana, FC	Sistemi di ricerca e sviluppo	2349-VN-100
IGF1 Proteina umana ricombinante	ThermoFisher Scientifico	PHG0078
Proteina di laminina di topo, naturale	ThermoFisher Scientifico	23017015
Proteina ricombinante dell'agrina umana	Sistemi di ricerca e sviluppo	6624-AG-050
Proteina GDNF umana ricombinante, CF 50ug	Sistemi di ricerca e sviluppo	212-GD-050/CF
Neurotrofina umana ricombinante 3 100 ug	Scienze cellulari	CRN500D
Neurotrofina-4 umana ricombinante	Scienze cellulari	CRN501B
Riccio sonico umano ricombinante/SHH (C24II) N-TERMMINUS	Sistemi di ricerca e sviluppo	1845-SH-100
Ricombinante Umano/Murino/Ratto BDNF 50 ug	Peprotech	450-02
Acido retinoico, 50 mg	Millipore Sigma	R2625-50
SAG Agonista levigato	Millipore Sigma	Codice: 566660
SB431542 10 mg compresse rivestite	Tecnologie delle cellule staminali	Codice: 72234
SteloMACS LDN-193189	Miltenyl Biotec	Codice 130-103-925
Vitronectina dal plasma umano	Millipore Sigma	V8379-50UG
Y-27632 dicloridrato	Tocris	Ore 1254
anticorpi
α-acticina mAb (IgG1 di topo)	Abcam	ab9465
Colina acetiltransferasi (ChAT) (Capra)	Millipore	AB144P
Desmin mAb (IgG1 di topo)	Dako	M076029-2
Catena pesante della miosina (MHC) (IgG2b di topo)	DSHB	MF20
attrezzatura
Arduino Uno R3	Arduino	A000066
Tavolino automatizzato	Strumentazione scientifica applicata	MS- 2000 XYZ
Pulitore al plasma espanso	Harrick Plasma	PDC-001 (115V)
Invitrogen Countess Contatore di celle automatizzato	Maresciallo Scientifico	CACC
IX-81 Microscopio a fluorescenza invertita	Olimpo	IX-ILL100LH
Serie Stage Top Incubator System	Tokai ha colpito STX	TOKAI-HIT-STXG
Zyla 4.2 sCOMS Fotocamera	Tecnologia Andor	ZYLA-4.2P-CL10
software
Software Arduino (IDE)	Arduino	IDE 1.8.19
Videocamera magistrale	Videocamera magistrale	Mastercam per Solidworks
Matlab	Matlab	Anno 2021b
Elementi NIS	Nikon	ricerca di base
CAD 3D di Solidworks	Solidworks	Standard Solidworks