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1. Preparazione della Linea Cellulare
- Scongelare circa 1.000.000 di cellule del midollo spinale di neuroblastoma di topo (cellule NSC-34) che sono state conservate in un contenitore di azoto liquido. Utilizzare un incubatore ad acqua a 37 °C fino a quando le cellule non sono completamente scongelate.
- Aggiungere un terreno fresco e caldo (DMEM contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS), l'1% di L-glutammina e l'1% di antibiotici per lo streptococco).
- Centrifugare le celle scongelate (SL16R) a 500 x g per 5 minuti, formando un pellet di cellule. Scartare il terreno e aggiungere 1 mL di nuovo terreno per la risospensione cellulare.
- Porre le cellule risospese in un matraccio da 15 mL e aggiungere altri 5 mL di terreno. Incubare le cellule per una notte in un incubatore sterile con il 5% di CO2 a 37 °C.
- In parallelo, posizionare 8 vetrini coprioggetti non rivestiti (vetro di copertura: 12 mm, 0,13-0,17 mm di spessore) in una piastra di coltura da 60 mm e sterilizzare utilizzando etanolo al 70% ed esposizione a 30 minuti di luce UV fino a quando non è asciutto. Aggiungere il terreno in ogni piatto e smaltire per lavare via l'etanolo residuo.
- Aggiungere tampone tripsina (2,5 g di tripsina e 0,2 g di EDTA in 1 L di soluzione salina bilanciata di Hanks) alle cellule dopo che hanno raggiunto circa il 90% di confluenza (circa 6 milioni di cellule per fiaschetta) per consentire alle cellule aderenti di dissociarsi.
NOTA: Le cellule NSC-34 sono sensibili e richiedono solo 15 s di incubazione del tampone tripsina e 1 minuto aggiuntivo di incubazione priva di tripsina prima della dissociazione con il terreno.
- Placcare le cellule sulle piastre di coltura da 60 mm che contengono già i vetrini coprioggetti con 3 mL di terreno, circa 350.000 per piastra. Lasciarli nell'incubatrice per 24 ore per consentire l'adesione delle cellule ai vetrini.
2. Validazione dell'Espressione Proteica
- Posizionare su ghiaccio piastre di coltura da 60 mm contenenti le cellule residue (non utilizzate nell'esperimento di cui sopra) di ciascun gruppo sperimentale.
- Smaltire il terreno e lavare le cellule due volte con PBS per diluire e lavare il terreno rimanente.
- Trattare le cellule con 200-400 μL di tampone di lisi contenente PBS, Triton allo 0,5% e compresse cocktail di inibitori della proteasi (PI). Raschiare con un raschietto per celle.
- Raccogliere le cellule nel tampone di lisi in una provetta da microcentrifuga e omogeneizzare con un omogeneizzatore a 4.000 giri/min per 1 minuto sotto ghiaccio.
- Centrifugare le cellule omogeneizzate a 2.500 x g per 10 minuti. Raccogliere il surnatante, quantificare la concentrazione proteica utilizzando un saggio di Bradford e conservare a -20 °C fino al momento dell'uso.
- Raccogliere tra i 30 e i 70 μg di proteine totali (a seconda della proteina) e caricarle in un gel SDS-PAGE per testare l'espressione proteica utilizzando un test di immunoblot.