1. Determinazione dell'espressione relativa delle proteine della superficie cellulare negli astrociti mediante biotinilazione
NOTA: Qui, illustriamo l'applicazione di questa tecnica di biotinilazione allo studio degli effetti della molecola della matrice extracellulare laminina sulla localizzazione della superficie cellulare del canale permeabile all'acqua-4 acquaporina-4 (AQP4). I materiali specializzati necessari per questo test includono sulfo-NHS-LC-biotina (sulfosuccinimidil 6-(biotinamido) esanoato) e resina di streptavidina-agarosio (vedi Tabella dei materiali).
- Utilizzando il metodo, preparare colture di astrociti corticali circa 2 settimane prima del test e farli crescere in fiasche di coltura ventilate da 75 cm2. Quando gli astrociti sono confluenti all'80-90%, staccarli dalla superficie di coltura utilizzando lo 0,05% di tripsina, quindi farli passare 1:3.
- A 48 ore prima del saggio, quando le cellule sono di nuovo confluenti all'80-90%, gli astrociti passano 1:3 (tenendo conto del cambiamento nel formato della coltura) su piastre di coltura cellulare da 60 mm in modo che siano confluenti al >70% il giorno in cui l'esperimento deve essere svolto. Assicurarsi che le celle siano distribuite uniformemente tra i piatti.
- A 16 ore prima del saggio, pipettare la laminina nel terreno di coltura a una concentrazione finale di 24 nM e incubare a 37 °C.
- Immediatamente prima del saggio, preparare quanto segue, quindi metterlo su ghiaccio o conservare in frigorifero: CM-PBS (100 mg/L MgCl2∙6H2O e 100 mg/L CaCl2 in soluzione salina tamponata con fosfato 1X [PBS], pH 7,4), tampone biotina (0,5 mg/mL sulfo-NHS-LC-biotina in CM-PBS), tampone di estinzione (50 mM NH4Cl in CM-PBS), tampone di lisi (25 mM Tris, pH 7,4, 25 mM di glicina, 150 mM di NaCl e 5 mM di acido etilendiamminotetraacetico [EDTA], 1% di tritone X-100, 1X cocktail di inibitori della proteasi), tampone di carico 3X (150 mM Tris, pH 6,8, 6% dodecil solfato di sodio [SDS], 30% di glicerolo, 300 mM di ditiotreitolo [DTT] e 0,01% di blu di bromofenolo) e tampone di lavaggio (10 mM Tris (pH 7,4), 1,5 mM EDTA, 150 mM di NaCl, 1% Triton X-100, 1X cocktail di inibitori della proteasi).
- Rimuovi i piatti che contengono le colture di astrociti dall'incubatrice e scarta il terreno.
- Lavare tre volte le celle con 4 ml di CM-PBS refrigerato e posizionare le stoviglie su ghiaccio tritato.
- Pipettare 2 ml di tampone di biotina in ciascun pozzetto e inclinare delicatamente le piastre avanti e indietro alcune volte per garantire una copertura completa. Lasciare in ghiaccio per 30 min.
- Rimuovere il tampone biotina utilizzando un aspiratore e sostituirlo con 4 mL di tampone estinguente. Lasciare in ghiaccio per 10 min.
- Aspirare il tampone di tempra e sostituirlo con un volume equivalente dello stesso. Anche in questo caso, lasciare in ghiaccio per 10 minuti.
- Eliminare il tampone di tempra e lavare le celle tre volte con 4 mL di CM-PBS refrigerato.
- Raschiare le cellule in 1 mL di CM-PBS refrigerato utilizzando un sollevatore di cellule e trasferire la sospensione in una provetta da microcentrifuga.
- Pellet di celle per centrifugazione a 100 x g per 3 min. Scartare il surnatante e risospendere le celle in 500 μL di tampone di lisi.
- Lasciare i campioni sul ghiaccio per 30 minuti, vorticando ogni 5 minuti, oppure posizionarli su un rotatore end-over-end a 4 °C.
- Centrifugare il lisato a 14.000 x g per 10 minuti a 4 °C per pellettare eventuali materiali insolubili come detergenti. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga.
- Risparmiare 50 μl di questo lisato e aggiungere un tampone di caricamento. Successivamente denaturarlo riscaldandolo a 95 °C in bagno asciutto; Questa è la frazione "in ingresso", che contiene sia proteine biotinilate della superficie cellulare, sia proteine citosoliche non biotinilate.
- Allargare l'apertura del puntale di una pipetta tagliando circa 0,5 cm di materiale dalla sua estremità utilizzando un paio di forbici affilate. Utilizzando questo puntale per pipetta, trasferire 75 μL di perle di streptavidina-agarosio (normalmente conservate a 4 °C) nel lisato e incubare a 4 °C per 3 ore su agitatore/bilanciere.
- Poiché la streptavidina-agarosio viene spesso venduta come impasto contenente il 50% di perle in volume, sospese in una soluzione antimicrobica, triturare il liquame per assicurarsi che le perle siano sospese in modo uniforme, quindi pipettare 150 μL di sospensione in ciascun campione.
- Perle di streptavidina-agarosio in pellet per centrifugazione a 1500 x g per 30 s a 4 °C.
- Conservare 50 μL di surnatante (aggiungere il tampone di carico e denaturarlo a 95 °C in un bagno d'acqua o in un blocco riscaldante); questo rappresenta la frazione "intracellulare" ed è costituito principalmente da proteine citosoliche non biotinilate.
- Risospendere le perle pellettate in 1 mL di tampone di lavaggio e agitarle per 3 minuti a 4 °C. Pellettare le perle (come al punto 1.16) ed eliminare il surnatante. Ripetere questo processo 4 volte per ridurre al minimo il legame aspecifico delle proteine citosoliche non biotinilate.
- Pellettare le perle mediante centrifugazione (1500 x g per 30 s a 4 °C) ed eliminare il tampone di lavaggio sovrastante. Aggiungere 50 μl di tampone di carico 1X (diluito utilizzando il tampone di lisi). Rilasciare biotina e streptavidina dalle perle denaturandole a 95 °C; Questa frazione deve contenere solo proteine biotinilate della superficie cellulare (frazione "cellula-superficie").
- Separare le frazioni di input, di superficie cellulare e intracellulari mediante SDS-PAGE (elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide) e analizzare mediante western blotting.
nota: Mentre nei nostri esperimenti abbiamo utilizzato un gel a gradiente prefabbricato al 4-20%, un gel di separazione al 12-14% con uno strato di impilamento al 4% (ciascuno contenente lo 0,1% di SDS) dovrebbe essere sufficiente per le proteine di interesse in questo studio. Dovrebbe essere utilizzato anche uno standard di peso molecolare dell'intervallo di dimensioni appropriato. Si noti che a volte può esserci un aumento osservabile delle masse molecolari apparenti delle proteine biotinilate.