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Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Determinazione del tasso di internalizzazione delle proteine della superficie cellulare negli astrociti mediante biotinilazione
NOTA: Di seguito, descriviamo un tipico esperimento di biotinilazione a caccia di impulsi utilizzato in questo caso per tracciare l'endocitosi di AQP4 negli astrociti. I materiali specializzati richiesti includono solfo-NHS-SS-biotina, resina streptavidina-agarosio, glutatione ridotto e iodoacetammide (vedi Tabella dei materiali).
- Preparare colture di astrociti corticali di topo in piastre da 60 mm utilizzando i metodi descritti nella sezione precedente. Assicurarsi che le cellule siano confluenti per circa il 70% il giorno del test e che ogni piastra contenga un numero equivalente di cellule.
- Immediatamente prima del saggio, preparare quanto segue e metterlo su ghiaccio o refrigerare: CM-PBS o soluzione salina tamponata con fosfato (100 mg/L MgCl2∙6H2O e 100 mg/L CaCl2 in 1X PBS, pH7.4), tampone biotina (0.5 mg/mL sulfo-NHS-SS-biotina in CM-PBS), tampone riducente (50 mM di glutatione ridotto, 75 mM NaCl e 75 mM NaOH), tampone di estinzione (50 mM di iodoacetammide, 1% BSA, in CM-PBS), tampone di lisi (25 mM di Tris, pH 7,4, 25 mM di glicina, 150 mM di NaCl e 5 mM di EDTA o acido etilendiamminetraacetico, 1% di tritone X-100, cocktail di inibitori della proteasi 1X), tampone di carico 3X (150 mM di Tris, pH 6,8, 6% SDS o sodio dodecil solfato, 30% di glicerolo, 300 mM di DTT o ditiotreitolo e 0,01% di blu di bromofenolo), e tampone di lavaggio (10 mM Tris, pH 7,4, 1,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% triton X-100, 1X cocktail di inibitori della proteasi).
- Preparare un terreno di coltura cellulare fresco (Dulbecco's Modified Eagle Medium; o DMEM integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), l'1% di penicillina/streptomicina e l'1% di L-glutammina) e metterlo in un bagno d'acqua a 37 °C.
- Rimuovere le colture di astrociti dall'incubatrice e aspirare il terreno utilizzando un aspiratore.
- Lavare le celle tre volte con 4 ml di CM-PBS refrigerato e posizionare le stoviglie su ghiaccio tritato.
- Pipettare 3 ml di tampone di biotina in ogni piatto, inclinare i piatti avanti e indietro alcune volte per assicurarsi che il tampone sia ben distribuito e lasciare in ghiaccio per 30 minuti.
- Aspirare il tampone di biotina e sostituirlo con 5 ml di terreno caldo. Incubare una piastra di coltura a 37 °C per 15 minuti e una seconda piastra alla stessa temperatura per 30 minuti. Lasciare un altro piatto a 4 °C come campione di 0 minuti.
- Al termine del periodo di incubazione, scartare il terreno e lavare le cellule tre volte con 4 mL di CM-PBS refrigerato. Pipettare 6 mL di tampone riducente sulle cellule e lasciarle in ghiaccio per 15 minuti.
- Rimuovere il tampone riducente e sostituirlo con 6 mL di tampone riducente fresco. Mettere il composto sul ghiaccio per altri 15 minuti.
- Rimuovere la soluzione riducente e sostituirla con 6 mL di tampone di spegnimento. Lasciare in ghiaccio per 15 min.
- Ripetere ancora una volta la fase di tempra.
- Eliminare il tampone di estinzione e lavare le celle tre volte con 4 mL di PBS refrigerato.
- Utilizzando un sollevatore di cellule, raschiare le cellule in 1 mL di PBS refrigerato e trasferire la sospensione in una provetta per microcentrifuga.
- Pellet le celle per centrifugazione a 100 x g per 3 min. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in un tampone di lisi da 500 μl.
- Lasciare il tutto in ghiaccio per 30 minuti e vorticare ogni 5 minuti. In alternativa, posizionare i campioni su un rotatore end-over-end a 4 °C per questa durata.
- Centrifugare il lisato a 14.000 x g per 10 minuti a 4 °C per pellettare i materiali insolubili nel detergente, quindi trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga. Conservare 50 μl di questo lisato, aggiungervi un tampone di carico e denaturarlo a 95 °C in un bagno asciutto; Questa è la frazione "in ingresso", contenente sia proteine endocitose biotinilate che proteine non biotinilate.
- Utilizzando un puntale di pipetta tagliato, aggiungere 150 μl di liquame di streptavidina-agarosio al lisato e incubare a 4 °C per 3 ore su uno shaker/rocker.
- Perle di streptavidina-agarosio in pellet per centrifugazione a 1.500 x g per 30 s a 4 °C.
- Risospendere le perle in 1 mL di tampone di lavaggio e farle oscillare per 3 minuti a 4 °C. Pellettare le perle (come al punto 1.18) ed eliminare il surnatante. Ripetere questo processo 4 volte per ridurre al minimo il legame aspecifico delle proteine citosoliche non biotinilate.
- Pellettare le microsfere per centrifugazione a 1.500 x g per 30 s a 4 °C ed eliminare il tampone di lavaggio sovrastante. Aggiungere 50 μl di tampone di caricamento 1X (diluito con tampone di lisi). Rilasciare la biotina e la streptavidina dalle perle denaturando a 95 °C; Questa frazione dovrebbe contenere solo proteine internalizzate della superficie cellulare (frazione "endocitosata").
- Separare le frazioni di input, di superficie cellulare e non legate mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide dodecil solfato di sodio (SDS-PAGE) e analizzate mediante western blotting.
nota: Mentre nei nostri esperimenti abbiamo utilizzato un gel a gradiente prefabbricato al 4-20%, un gel di separazione al 12-14% con uno strato di impilamento al 4% (ciascuno contenente lo 0,1% di SDS) dovrebbe essere sufficiente per le proteine di interesse in questo studio. Dovrebbe essere utilizzato anche uno standard di peso molecolare dell'intervallo di dimensioni appropriato. Si noti che a volte può esserci un aumento osservabile delle masse molecolari apparenti delle proteine biotinilate.