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Articolo metodologico

Valutazione dell'internalizzazione delle proteine di superficie bersaglio utilizzando un derivato della biotina

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8 luglio 2025

In questo articolo

Abstract

Fonte: Tham, D. K. L., et al., Determinazione dell'espressione della superficie cellulare e del tasso endocitico delle proteine nelle colture primarie di astrociti utilizzando la biotinilazione. (2017).

Questo video mostra un metodo per valutare l'internalizzazione della proteina bersaglio negli astrociti corticali di topo utilizzando la biotinilazione, seguita dalla lisi cellulare, dall'estrazione di proteine a base di streptavidina, dalla denaturazione e dall'analisi Western blot per confermare il successo dell'internalizzazione.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Determinazione del tasso di internalizzazione delle proteine della superficie cellulare negli astrociti mediante biotinilazione

NOTA: Di seguito, descriviamo un tipico esperimento di biotinilazione a caccia di impulsi utilizzato in questo caso per tracciare l'endocitosi di AQP4 negli astrociti. I materiali specializzati richiesti includono solfo-NHS-SS-biotina, resina streptavidina-agarosio, glutatione ridotto e iodoacetammide (vedi <....

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Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Albumina sierica bovinaSigma-AldrichCodice A9647-50
Blu di bromofenoloBio-Rad#1610404
Cocktail completo di inibitori della proteasiSigma-Aldrich11697498001
Etilendiamminotetraacetato disodico diidrato (EDTA)Bio-Rad#1610729
Ditiotreitolo (DTT)Bio-Rad#1610611
Eagle Medium modificato di Dulbecco (DMEM)Gibco/Thermo Fisher ScientificCodice 11960-044
EZ-Link Sulfo-NHS-SS-BiotinaThermo Fisher Scientifico#21331
Siero fetale bovinoGibco/Thermo Fisher ScientificCodice 16000-044
gliceroloFisher ScientificoBP229-1
glicinaSigma-AldrichG8898
IodoacetammideBio-Rad#163-2109
L-glutamminaGibco/Thermo Fisher ScientificCodice 25030-081
Penicillina/streptomicinaGibco/Thermo Fisher ScientificCodice: 15140-122
Perossidasi AffiniCapra Pura Anti-Coniglio IgG (H+L)Laboratori di immunoricerca JacksonCodice 111-035-045
Soluzione salina tampone fosfatoGibco/Thermo Fisher ScientificCodice 10010-023
Glutatione ridottoSigma-AldrichG6529
Cloruro di sodio (NaCl)Fisher ScientificoEpisodio 271-500
Dodecil solfato di sodio (SDS)Sigma-AldrichCodice 862010
Idrossido di sodio (NaOH)Fisher ScientificoS318-100
Resina di agarosio di streptavidinaThermo Fisher Scientifico#20347
Anticorpo policlonale anti-AQP4 di coniglioAlomoneAQP-004
Base Tris (Base Trizma)Fisher ScientificoBP152-1
Tris-HClFisher ScientificoBP153-1
Triton X-100Fisher ScientificoBP151-500

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