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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione delle matrici
- Far bollire 4-8 matrici siliconiche in un forno a microonde o su una piastra calda per 5 minuti e lasciarle asciugare completamente per 1 ora sotto flusso laminare (lato striato rivolto verso l'alto).
nota: Le seguenti procedure devono essere eseguite in flusso laminare.
- Soffiare aria compressa o utilizzare del nastro adesivo trasparente per rimuovere la polvere dal lato rigato delle matrici. Mantenere pulito il lato a strisce in modo che possa aderire saldamente alla superficie della piastra.
- Posizionare con cura le matrici su piatti di plastica da 6 cm premendo con un dito (una matrice per piatto; striscia con il lato rivolto verso il basso). Evitare che si formino bolle d'aria tra la matrice e il piatto. Segna la posizione delle strisce sul lato inferiore del piatto di coltura.
- Se la matrice non si attacca, ripetere dal passaggio 1.2.
2. Generazione di strisce e rivestimento di laminina per la coltura dei neuroni
- Preparare una proteina ricombinante marcata con fluorescenza (25 μl ciascuna per l'iniezione [fase 2.2] o 100 μl ciascuna per il metodo di posizionamento [fase 2.2.1]) mescolando la proteina marcata con Fc (10-50 μg/ml) e un anticorpo Fc umano coniugato con colorante fluorescente (rapporto 1-3: 30-150 μg/ml) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Quindi, incubare la miscela per 30 minuti a RT.
- Utilizzando una siringa da 22 G, iniettare 25 μl della proteina ricombinante preparata nel passaggio precedente (2.1) attraverso il piccolo foro sul lato della matrice (frecce nelle Figure 1A, 1C e 1E).
- In alternativa, posizionare 100 μl della proteina ricombinante nella fessura superiore della matrice e aspirare circa metà della soluzione dal piccolo foro (frecce nelle Figure 1A, 1C e 1E), in modo che la proteina ricombinante rimanga nelle regioni a strisce.
- Incubare la piastra per 30 minuti a 37 °C in un incubatore per colture cellulari.
- Posizionare 300 μl di PBS nella fessura superiore (Figura 1B) e aspirare dal piccolo foro situato sul lato della matrice (frecce nelle Figure 1A, C ed E) per rimuovere le proteine ricombinanti non attaccate. Non aspirare completamente il PBS, perché le proteine si seccheranno. Ripetere questo passaggio due volte. (3 volte totale)
- Rimuovere con cautela la matrice e posizionare immediatamente ~100 μl di proteina di controllo (10-50 μg/ml; Fc) per coprire l'intera area rigata, creando un rivestimento alternato. Quindi, incubare la piastra per 30 minuti a 37 °C nell'incubatore per colture cellulari.
- Dopo aver lavato la superficie del piatto tre volte con PBS, rivestirlo con ~100 μl di 20 μg/ml di laminina in PBS.
nota: La laminina deve essere scongelata con ghiaccio per evitare la solidificazione.
- Incubare la piastra per 1 ora a 37 °C nell'incubatore per colture cellulari.
- Lavare la superficie del piatto tre volte con PBS e aggiungere il terreno di coltura. Collocare la piastra rivestita con terreno di coltura in un incubatore al 5% di CO2 a 37 °C fino al momento dell'uso.
3. Coltura di neuroni ippocampali da embrioni di topo E15.5
- Eutanasia della madre tramite lussazione cervicale e isolamento di tre embrioni E15.5.
- Taglia la pelle e il cranio agittalmente sulla linea mediana della testa con le forbici e rimuovi il cervello usando un cucchiaino. Trasferire con cura il cervello in una capsula di Petri da 60 mm contenente 3 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS).
- Usando un bisturi, ritaglia gli emisferi tra cui la corteccia, l'ippocampo e lo striato (Figura 2A). Quindi, sezionare la regione ippocampale rimuovendo con cura le meningi e trasferire i tessuti ippocampali sezionati in una provetta da centrifuga da 15 ml contenente 2 ml di soluzione HBSS, su ghiaccio (Figura 2B-C). Raccogli 6 ippocampi da 3 embrioni nella provetta, che sono sufficienti per coltivare i neuroni in 8 piatti.
- Sostituire la soluzione HBSS con una soluzione di tripsina/acido etilendiammina tetraacetico (tripsina/EDTA) (2 ml) e incubare la provetta a 37 °C per 15 minuti in bagnomaria.
nota: Aspirare l'HBSS senza centrifugazione e non travasare la soluzione di HBSS inclinando la provetta.
- Neutralizzare l'attività della tripsina aggiungendo 500 μl di siero fetale bovino (FBS).
- Centrifugare la miscela a 100 x g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet con 2 ml di terreno di coltura. Ripeti questo passaggio ancora una volta.
- Pipet l'ippocampo su e giù 10 volte in un terreno di coltura utilizzando una punta da 1.000 μl con un grande foro (cut-tip) per dissociare il tessuto.
- Passare a un puntale regolare (non tagliato) da 1.000 μl e pipettare il tessuto dissociato su e giù per ottenere una sospensione a cellula singola.
- Separare le singole cellule facendole passare attraverso un filtro cellulare a rete da 80-100 μm.
- Centrifugare la sospensione filtrata a cellula singola a 150 x g per 5 minuti.
- Rimuovere il surnatante mediante aspirazione e risospendere il pellet (neuroni) in 2 ml di terreno di coltura.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro con colorazione blu di tripano per determinare la densità e la vitalità. Quindi, piastra 10.000 neuroni in 150 μl di terreno di coltura per ogni serie di strisce. La sospensione deve essere posizionata con cura in modo da coprire l'intera regione della striscia.
