Consegna di una lesione cerebrale traumatica al cervello di un topo

Abstract

Fonte: Zhong, J., et al. Imaging intravitale dell'espressione proteica fluorescente nei topi con una lesione cerebrale traumatica a cranio chiuso e finestra cranica utilizzando un microscopio a due fotoni. J. Vis. Exp. (2023)

Questo video dimostra la somministrazione di lesioni cerebrali traumatiche (TBI) nei topi. Dopo aver esposto il cranio, il sito del trauma cranico viene contrassegnato. Il mouse viene quindi posizionato sotto il dispositivo TBI. L'impatto viene sferrato sollevando l'asta di metallo e lasciandola cadere liberamente sull'impattatore, che è a contatto con il cranio.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Somministrazione di un'induzione ripetitiva di una lesione cerebrale traumatica (TBI)

NOTA: I parametri del TBI sono regolati rispetto ai rapporti precedenti, in cui l'impatto del TBI è stato fornito una volta. Il protocollo qui applica lo stesso parametro, tranne per l'aumento del numero di impatto totale a 10.

1. Apparecchiature TBI
   1. Utilizzare un dispositivo portatile personalizzato per somministrare un trauma cranico chiuso (Figura 1A) alla testa del mouse sul lato destro, come indicato nella Figura 1B.
2. Preparazione prima dell'intervento chirurgico
   1. Attrezzature per chirurgia in autoclave, tra cui forbici normali, un calibro chirurgico, forbici a molla chirurgica, pinze chirurgiche, pinze per zanzare, pezzi di testa, garze e applicatori con punta in cotone.
   2. Pesare e registrare il peso corporeo del topo 2 ore prima dell'intervento. Per ridurre al minimo l'edema cerebrale durante l'impianto della finestra cranica, iniettare desametasone fosfato sodico alla dose di 4,8 mg/kg [2 mg/mL, di solito ~70 μl (è necessario iniettare in due siti)] nel muscolo quadricipite utilizzando una siringa da insulina. Dopo l'iniezione di desametasone, ma prima di iniziare l'intervento chirurgico di trauma cranico, preparare le finestre di vetro come indicato al punto 2.1 per un uso successivo.
   3. Disinfettare la fase chirurgica e l'attrezzatura per trauma cranico utilizzando etanolo al 75%. Espandere il telo chirurgico sterile monouso per coprire la fase chirurgica sulla piattaforma stereotassica. Accendere l'apparecchio di riscaldamento e il monitor della temperatura, impostando la temperatura target a 37 °C.
   4. Aprire la valvola del serbatoio di ossigeno e regolare il flusso di ossigeno a 1,5 L/min. Aprire la macchina per anestesia e impostare il valore del livello di isoflurano su tre
      NOTA: l'ossigeno puro al 100% può aiutare l'animale a sopravvivere agli impatti del trauma cranico.
   5. Metti il mouse nella camera di induzione e lascialo riposare per 5 minuti per ottenere un'anestesia completa.
   6. Una volta che il topo è completamente anestetizzato (cioè una frequenza respiratoria lenta ma costante a circa un ciclo ogni 2 s, unita all'assenza di un riflesso di pizzicamento della coda), rimuovere il topo dalla camera di induzione e posizionare la testa del topo nel telaio stereotassico.
   7. Posizionare il cono del tubo per anestesia sul muso del topo.
   8. Mantenere l'anestesia utilizzando isoflurano all'1,5% miscelato con ossigeno puro al 100% a una portata di 1 L/min fino alla fine dell'intervento chirurgico. Controllare periodicamente la frequenza del respiro ed eseguire un pizzicamento della coda o delle dita dei piedi almeno ogni 15 minuti durante l'intervento chirurgico per valutare l'anestesia appropriata. Regolare la concentrazione di isoflurano in modo appropriato per mantenere la profondità di anestesia desiderata.
3. Chirurgia del trauma cranico
   1. Somministrare buprenorfina (1 mg/kg, per via sottocutanea) utilizzando siringhe da insulina monouso e applicare un unguento oftalmico sugli occhi del topo.
   2. Rimuovere i peli dalla sommità della testa tagliandoli con le forbici 1 e poi applicando un agente depilatorio per 1 min.
      ATTENZIONE: Non applicare il prodotto depilatorio per più di 3 minuti sul cuoio capelluto, poiché è irritante per la pelle. Inoltre, evitare di far entrare qualsiasi agente depilatorio negli occhi del topo.
   3. Pulisci la pelle del cuoio capelluto applicando una garza e applicatori con punta di cotone. Quindi, disinfettare la pelle, utilizzando prima etanolo al 75% e poi betadina. Ripeti l'operazione tre volte (cioè etanolo seguito da betadina), lasciando l'applicazione finale di betadina sulla pelle.
   4. Ricontrollare la profondità dell'anestetico per assicurarsi che il topo sia completamente anestetizzato (cioè, frequenza respiratoria lenta ma costante a circa un ciclo ogni 2 s, unita all'assenza di un riflesso di pizzicamento della coda). Tendere la pelle con una pinza chirurgica 3 e praticare un'incisione sulla linea mediana lunga 12-15 mm a partire da circa 3 mm posteriormente dagli occhi.
   5. Asportare la pelle sopra l'emisfero sinistro e destro del cranio usando le forbici a molla 2.
   6. Una volta che il cranio è esposto, rimuovere il periostio strofinandolo delicatamente con un applicatore sterile con punta di cotone e sciacquandolo con soluzione fisiologica sterile.
   7. Ispezionare visivamente le condizioni del cranio per assicurarsi che sia intatto, ad eccezione dei due piccoli fori, che sono stati realizzati per il precedente intervento di iniezione del virus.
   8. Asciugare l'area del cranio e contrassegnare il sito di impatto del trauma cranico alle seguenti coordinate: 2,5 mm posteriormente al Bregma e 2 mm lateralmente dalla sutura sagittale a destra (Figura 1B).
   9. Rimuovere rapidamente il mouse dal telaio stereotassico e posizionare la testa sul cuscino tampone sotto il dispositivo TBI.
   10. Allineare la punta dell'impattatore con il punto di impatto contrassegnato.
   11. Sollevare la colonna metallica tirando la corda di nylon legata a 15 cm sopra la testa del mouse, quindi rilasciarla, lasciando che il peso cada liberamente sull'asta del trasduttore, che è a contatto con la parte superiore del cranio nel sito del trauma cranico. Non toccare la testina del mouse durante l'erogazione dell'impatto TBI.
   12. Sposta il mouse sulla coperta riscaldante e posizionala sulla schiena monitorando lo stato della respirazione.
   13. Una volta che il topo si raddrizza da una posizione supina a una prona, posizionarlo nella camera di induzione dell'isoflurano per ~5 minuti con isoflurano al 3% miscelato con ossigeno puro al 100% a una portata di 1,5 L/min.
   14. Una volta che il topo è completamente sedato (cioè, frequenza respiratoria lenta ma costante a circa un ciclo ogni 2 s, insieme all'assenza di un riflesso di pizzicamento della coda), ripetere i passaggi 1.3.9-1.3.14 per ottenere un totale di 10 impatti.
       NOTA: Nel nostro studio è stato riscontrato che dieci impatti del trauma cranico inducono un fenotipo robusto con bassa mortalità dei topi (dati non ancora pubblicati). I parametri possono essere regolati per ottenere una diversa gravità della lesione cerebrale aumentando o diminuendo il numero di impatti e/o l'altezza da cui viene rilasciato il peso. Tutti i parametri sono soggetti all'approvazione dell'IACUC locale.
   15. Controllare il cranio al microscopio operatorio e rimuovere il topo dallo studio se si è verificata una frattura del cranio.
   16. Per la chirurgia fittizia, seguire le stesse procedure descritte sopra, incluso il posizionamento dell'animale sotto l'impattatore ma senza erogare gli impatti del trauma cranico.
   17. Dopo che il topo si è raddrizzato da una posizione supina a una prona dopo il 10° impatto con trauma cranico, posizionarlo nella camera di induzione dell'isoflurano per ~5 minuti. Quindi, seguire i passaggi 1.2.6-1.2.8 per posizionare la testa del topo sul telaio stereotassico per l'intervento di impianto della finestra cranica descritto di seguito.

Risultati

Figura 1: Diagrammi per il dispositivo TBI, il sito di impatto TBI e la preparazione della finestra. (A) Attrezzatura per il dispositivo TBI a caduta di peso. 1: piedistallo, 2: staffa, 3: morsetto regolabile, 4: corda in nylon, 5: tunnel di caduta pesi, 6: colonna di peso in metallo (50 g), 7: impattatore, 8: cuscino tampone. (B) Uno schema dell'iniezione del virus e del sito di impatto del trauma c...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Pennelli applicatori di precisione regolabili	Parkell	S379
Siringa da insulina BD	Bd	NDC/HRI#08290-3284-38	5/16" x 31G
Betadina	Purdue	NDC67618-151-17	Di cui 7,5% di iodio povidone
Buprenorfina	PAR Farmaceutico	NDC 42023-179-05
Ethonal	Fisher Scientifico	Codice 04355223EA	75%
Apparecchi di riscaldamento	CWE	Mouse TC-1000	Dotato dello strumento stereotassico e utilizzabile durante l'intervento chirurgico
Coperta riscaldante	Farmacia CVS	E12107	Dispositivo di riscaldamento extra e da utilizzare dopo l'intervento chirurgico
Unguento oftalmico lubrificante	Picetale	NDC 46066-753-55
marcatore	Delasco	SMP-BK
Pinze per zanzare	Carolina	Articolo #:625314	Acciaio inossidabile, curvo, 5 in
Agente depilatorio	Società McKesson	N/A	Nair Hair Lozione Depilatoria Aloe & Lanolina
Forbice normale 1	Eurostat	Eurostat ES5-300
Forbice normale 2	Strumenti di precisione mondiali	n° 501759-G
salino	Mondo biologico	L19102411PR
Forbice a molla 1	Strumenti di precisione mondiali	n° 91500-09	Punta dritta
Forbice a molla 2	Strumenti di precisione mondiali	n° 91501-09	Punta dritta
Piattaforma stereotassica	KOPF	Modello 900LS
Pinze chirurgiche 1	SCIENZE DELLA MICROSCOPIA ELETTRONICA	Registro cat# 0508-5/45-PO	Stile 5/45, curvo
Pinze chirurgiche 2	SCIENZE DELLA MICROSCOPIA ELETTRONICA	catlog# 0103-5-PO	Stile 5, dritto
Pinze chirurgiche 3	SCIENZE DELLA MICROSCOPIA ELETTRONICA	catlog# 72912
Pinze chirurgiche 4	SCIENZE DELLA MICROSCOPIA ELETTRONICA	Registro cat# 0508-5/45-PO	Stile 5/45, curvo
Lampada scialitica	Leica	Leica KL300 LED
Adesivo tissutale Vetbond	3M Cura degli animali	Numero di parte: 014006