Immunocolorazione a fluorescenza di neuroni ippocampali di ratto all'interno di un chip microfluidico

Abstract

Fonte: Nagendran, T., et al., Uso di chip microfluidici in plastica preassemblati per la compartimentazione dei neuroni murini primari. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video dimostra la colorazione in immunofluorescenza di neuroni ippocampali di ratto coltivati all'interno di un chip microfluidico per analizzare la maturazione e la connettività neuronale.

Protocollo

1. Immunocolorazione a fluorescenza all'interno del chip

1. Preparare una soluzione di fissazione della formaldeide al 4% in PBS (formaldeide al 4%, 1 μM di MgCl₂, 0,1 μm di CaCl₂, 120 mM di saccarosio)
2. Rimuovere la maggior parte del supporto nei pozzetti del chip (non asciugare gli scomparti interni).
3. Aggiungere immediatamente 100 μl di soluzione di fissazione ai pozzetti superiori dei compartimenti assonale e somatico.
4. Dopo 1 minuto, aggiungere 100 μL di soluzione di fissazione ai pozzetti inferiori. Fissare per 30 minuti a temperatura ambiente.
5. Rimuovere la maggior parte della soluzione dai pozzetti del truciolo (non asciugare gli scomparti interni). Aggiungere immediatamente 150 μl di PBS a ciascuno dei pozzetti superiori dei compartimenti assonale e somatico. Attendere 2 minuti affinché il PBS scorra nei pozzetti inferiori.
6. Ripetere il passaggio 1.5 due volte.
7. Rimuovere la maggior parte del PBS dai pozzetti del chip. Aggiungere immediatamente 150 μl di PBS con TritonX-100 allo 0,25% a ciascuno dei pozzetti superiori dei compartimenti assonale e somatico. Attendere 15 min.
8. Rimuovere la maggior parte del liquido dai pozzetti del chip e aggiungere immediatamente 150 μL di soluzione bloccante (10% di siero di capra normale in PBS) a ciascuno dei pozzetti superiori dei compartimenti assonale e somatico. Attendere 15 min.
   nota: Le soluzioni bloccanti efficaci dovrebbero essere specifiche per l'anticorpo secondario, ad esempio, per un anticorpo secondario anti-pecora d'asino, utilizzare siero d'asina nella soluzione bloccante.
9. Rimuovere la maggior parte del liquido dai pozzetti del chip e aggiungere immediatamente 100 μL di anticorpo primario (o anticorpi) in siero di capra normale all'1% in PBS a ciascuno dei pozzetti superiori dei compartimenti assonale e somatico. Coprire per ridurre al minimo l'evaporazione e attendere 1 ora a temperatura ambiente o 4 °C per tutta la notte.
10. Rimuovere la maggior parte della soluzione dai pozzetti del truciolo (non asciugare gli scomparti interni). Aggiungere immediatamente 150 μl di PBS a ciascuno dei pozzetti superiori dei compartimenti assonale e somatico. Attendere 5 minuti affinché il PBS scorra nei pozzetti inferiori.
11. Ripetere il passaggio 1.10 due volte.
12. Rimuovere la maggior parte del liquido dai pozzetti del chip e aggiungere immediatamente 100 μL di anticorpo secondario (o anticorpi) in PBS a ciascuno dei pozzetti superiori dei compartimenti assonale e somatico. Coprire per ridurre al minimo l'evaporazione e attendere 1 ora a temperatura ambiente.
    nota: Fare riferimento alle istruzioni del produttore per la diluizione raccomandata degli anticorpi secondari.
13. Ripetere i passaggi 1.10-1.11.
14. Se si esegue l'imaging entro 1 giorno dall'immunocolorazione, mantenere il chip pieno di PBS. Se il chip verrà conservato per più di 1 giorno prima dell'imaging, avvolgere la piastra contenente il chip in una pellicola di paraffina per evitare l'evaporazione e conservarla a 4 °C fino al momento dell'imaging.
15. Per la conservazione a lungo termine dei campioni, è possibile utilizzare terreni di montaggio (ad es. Fluoromount-G).
    1. Rimuovere la maggior parte del liquido dai pozzetti del chip. Utilizzare una pipetta di plastica monouso da 1 ml per aggiungere 2 gocce di terreno di montaggio a ciascuno dei pozzetti superiori dei compartimenti assonale e somatico.
    2. Inclinare il chip per favorire il flusso del supporto di montaggio attraverso i canali. Dopo 5 minuti, aggiungere 2 gocce ai pozzetti inferiori. Attendere 1 ora prima di imaging.
       nota: Dopo aver utilizzato il supporto di montaggio, non sarà possibile sondare nuovamente altri target.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Chip XonaChip	Xona Microfluidics, LLC	XC150	Barriera a microscanalature di lunghezza 150 μm
Chip XonaChip	Xona Microfluidics, LLC	XC450	Barriera a microscanalature di lunghezza 450 μm
Chip XonaChip	Xona Microfluidics, LLC	XC900	Barriera a microscanalature di lunghezza 900 μm
Pre-rivestimento XC	Xona Microfluidics, LLC	XC Pre-Cappotto	incluso con XonaChips
XonaPDL	Xona Microfluidics, LLC	XonaPDL
Terreno neurobasale	ThermoFisher Scientifico	21103049
Pipette in vetro Pasteur	Sigma-Aldrich	CLS7095D5X SIGMA
Forare il 16% di formaldeide	ThermoFisher Scientifico	Codice 28906
PBS (10x)	ThermoFisher Scientifico	QVC0508
Siero di capra normale	ThermoFisher Scientifico	16210064
Triton X-100	ThermoFisher Scientifico	Codice 28314
Anticorpo anti-vGlut1	NeuroMab	75-066	clone N28/9, 1:100
Anticorpi secondari Alexa Fluor	ThermoFisher Scientifico		Ore 17:40
Sistema di imaging confocale a disco rotante	Tecnologia Andor	EMCCD CSU-X1, iXon X3	60x olio di silicone e 20x obiettivi