Quantificazione dell'actina puntina filamentosa nei neuroni corticali di ratto

Abstract

Fonte: Li, H., et al. Quantificazione dei puncta filamentosi di actina (F-actina) nei neuroni corticali di ratto. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video mostra la procedura per colorare in modo fluorescente i neuroni corticali di ratto per la microscopia. Si rivolge alla F-actina e alle proteine dendritiche per analizzare l'integrità strutturale e calcolare la densità della F-actina, che è fondamentale per studiare la funzione e la salute neuronale.

Protocollo

1. Marcatura fluorescente e immunocitochimica

Nota: La marcatura immunofluorescente di colture cellulari corticali primarie è stata effettuata in piastre di coltura cellulare da 35 mm con fondo di vetro con un volume di lavoro di 1 ml.

1. Lavare due volte la pirofila con fondo di vetro con soluzione salina tamponata con fosfato a pH 7,4 (PBS).
2. Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente (RT).
3. Lavare le celle due volte con PBS e permeabilizzare con Triton X-100 allo 0,1% in PBS per 5 minuti.
4. Trattare le cellule per 20 minuti a RT con una colorazione specifica per F(filamentosa)-actina, AlexaFluor 488 Falloidina (1:40, 25 μl di falloidina in 1 ml di PBS).
5. Sciacquare le cellule due volte con PBS e bloccare con il 10% di siero di capra normale a RT per 1-2 ore.
6. Diluire l'anticorpo policlonale di pollo anti-MAP2 (proteina 2 associata ai microtubuli) (1:2.500) in PBS con il 2% di siero di capra normale e incubare O/N (durante la notte) a 4 ⁰C.
7. Dopo l'incubazione, sciacquare due volte con PBS.
8. Diluire l'anticorpo secondario (Alexa Red 594-coniugato capra anti-pollo IgG (1:500) con il 2% di siero di capra normale e incubare per 2 ore a RT.
9. Risciacquare con PBS e aggiungere 10 μl/piatto di colorante Hoesht.
10. Incubare per 3 minuti a RT e lavare con PBS due volte.
    nota: Le cellule marcate sono ora pronte per la fase 2 (conteggio dei punti F-actina).
11. Conservare il campione cellulare con 100 μl di reagente antidissolvenza come agente scivolante e tenerlo a 4 ⁰C al buio per una conservazione a lungo termine.
    nota: La falloidina è relativamente stabile nella PBS a +4 °C al buio per un massimo di 1 settimana e la fluorescenza può essere preservata con i reagenti vetrino antisbiadimento. Tuttavia, le immagini ottimali si ottengono da 1 a 3 giorni dopo la colorazione, poiché la falloidina può iniziare a diffondersi con una conservazione prolungata.

2. Conteggio dei puncta F-actin

1. Accendi il microscopio a fluorescenza e passa all'obiettivo da 20×. Aprire il software del microscopio e impostare il programma con una dimensione dell'immagine di 1280×960 pixel e una risoluzione dell'immagine di 0,17 μm/pixel con uno zoom di 1×.
2. Acquisire immagini di neuroni F-actina/MAP2 co-marcati sotto canali fluorescenti verdi (495 nm) o rossi (613 nm).
3. Scegli 5 immagini fluorescenti immunomarcate verdi (F-actina)/rosse (MAP2) / blu (Hoescht) di singoli neuroni con perni dendritici chiaramente definiti.
4. Identificare le strutture ricche di F-actina nel segmento dendritico del secondo ordine (intervallo di lunghezza 25-75 μm) con immunofluorescenza continua MAP2.
5. Ruota l'area selezionata delle immagini a un livello orizzontale. Copia e incolla come nuova immagine.
6. Sottrai lo sfondo delle immagini, utilizzando una regolazione coerente per ogni piatto.
7. Conta i punti F-actina verde brillante e traccia manualmente la lunghezza del segmento dendritico selezionato da osservatori indipendenti addestrati. Esporta i dati in un file di foglio di calcolo.
8. Calcolare la densità dividendo i punti totali marcati con F-actina (N) per la lunghezza (L) dei dendriti marcati con MAP2. Esprimere i dati come numero di F-actina puncta per 10 μm di dendrite
   nota: I puncta (dimensioni ≤1,5 μm) di fluorescenza F-actina con un'intensità di picco di almeno il 50% superiore all'intensità media di colorazione nello sfizio dendritico sono stati inclusi in ciascun segmento dendritico selezionato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piatti con fondo in vetro da 35 mm n. 1,5 vetrino coprioggetto	Società MatTek	P35G-1.5-20-C
DMEM/F12 medio	Tecnologie per la vita	Codice 10565-018
Poli-L-lisina	sigma	P9155
Paraformaldeide	sigma	P6148
AlexaFluor 488 Falloidina	Tecnologie per la vita	Codice A12379
Siero normale per cavalli	Tecnologie per la vita	Codice 26050-070
Policlonale di pollo anti-MAP2	abcam	Codice ab92434
Alexa Red 594 capra coniugata anti-pollo IgG	Tecnologie per la vita	Codice: A11042
NucBlue Colorazione per cellule vive ReadyProbes Reagente Hoescht 33342	Tecnologie per la vita	R37605
Pacchetto software NIS-Elements	Strumenti Nikon
Nikon Eclipse TE2000-E microscopio fluorescente invertito controllato da computer	Strumenti Nikon