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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Animali
- Utilizzare ratti maschi e femmine di 3 mesi di età in questo studio.
- Mantieni gli animali in un ciclo luce/buio di 12 ore con libero accesso a cibo e acqua.
2. Preparazione del cocktail KAX (ketamina + xilazina + acepromazina) per anestesia animale
- Sciogliere 50 mg di xilazina (20 mg/ml) in 5 ml di ketamina (100 mg/ml) con 1 ml di acepromazina (10 mg/ml) e 3 ml di acqua distillata. Mescolare accuratamente.
- Sterilizzare con un filtro per siringa e conservare questa soluzione in un flacone di siero da 10 ml.
3. Iniezione KAX
- Pesare l'animale (g) e rimetterlo nella gabbia fino al momento dell'iniezione.
- Iniettare 0,1 ml di KAX/100 g di peso corporeo animale per via intraperitoneale, utilizzando una siringa da insulina da 1 ml con un ago da 28 G.
- Consenti all'animale di perdere conoscenza. Controlla i riflessi pizzicando le zampe e la coda.
- Tenere tutti gli animali al sicuro in laboratorio per tutta la durata dell'intervento chirurgico.
- Dopo l'intervento chirurgico, riposizionare gli animali nelle loro gabbie e mantenerli comodi a temperatura ambiente (RT) fino a quando non si riprende conoscenza. Riportare gli animali nella struttura per animali solo quando gli animali si svegliano e riprendono il normale comportamento.
4. Preparazione per l'intervento chirurgico e assemblaggio di microaghi
- Preparare una soluzione sterile di NaCl 2 M.
- Utilizzare un estrattore per microelettrodi (Figura 1C) per estrarre un tubo in borosilicato standard lucidato pesante e a parete sottile di 0,86 mm di diametro interno in due microaghi di vetro finemente conici (Figura 1D, Figura 1E).
- Riempire un microago del passaggio precedente con soluzione fisiologica 2 M utilizzando un ago per siringa di riempimento e una siringa da 1 ml (Figura 1B). Eliminare le bolle d'aria dalla punta dell'elettrodo.
- Riempire una seconda siringa da 1 ml con 2 M di NaCl. Collegare un ago da 18 G e quindi collegare una lunghezza (circa 10 pollici) di tubo in polietilene (Figura 1A). Utilizzare lo stantuffo della siringa per riempire il tubo di polietilene con soluzione fisiologica attraverso l'ago.
- Quando sia il microago che il tubo sono riempiti di soluzione fisiologica, collegare accuratamente i due. Eliminare l'aria nel collegamento tra di loro (Figura 2).
- Smussare finemente la punta del microago raschiando molto leggermente contro la grana di un tovagliolo di carta da corso.
- Controllare la resistenza del microago spingendo delicatamente lo stantuffo sulla siringa fino a quando non si vede un sottile flusso di liquido sul tovagliolo di carta. Il flusso di liquido non deve essere più largo di 0,5 mm.
5. Preparazione dell'animale
- Applicare 1-2 gocce di anestetico topico sulla cornea (soluzione oftalmica di proparacaina cloridrato, USP, 0,5%). Attendere che non si verifichi alcun riflesso oculare.
- Taglia i baffi con le forbici.
- Saturare un applicatore con punta di cotone con una soluzione di betadina e tamponare l'area intorno all'occhio sperimentale.
- Usando un microscopio, collegare un emostatico per bloccare la palpebra inferiore per gonfiare l'occhio, esporre la vena episclerale e limitare il movimento degli occhi. (Figura 3, punta di freccia)
6. Iniezione di soluzione salina che induce il glaucoma
- Quando l'assemblaggio del microago e l'animale sono preparati, iniziare le iniezioni.
- Quando è confermato che l'animale non risponde al pizzicamento dei piedi/della coda, perforare con cura la vena episclerale con il microago avvicinandosi a un angolo basso tra 10 e 20 gradi rispetto alla vena (Figura 3, freccia bianca). Una puntura riuscita nella vena è evidente quando il sangue entra nella punta del microago (Figura 3, freccia nera).
- Iniettare lentamente e manualmente circa 50 μl di soluzione salina nella vena. L'operazione dovrebbe richiedere circa 10 secondi. Le vene sbiancano mentre il sale circola attraverso il sistema vascolare (Figura 4, punta di freccia). Alcune regioni possono mantenere un aspetto rosso sangue (Figura 4, freccia).
- Eseguire una seconda iniezione nella vena, opposta al sito della prima, per garantire un danno retinico completo all'intero strato di cellule gangliari retiniche><.
Nota: in pochi minuti, si dovrebbe vedere un distinto aspetto torbido attraverso l'iride dell'occhio mentre il sale circola attraverso il sistema vascolare.
- Lasciare l'occhio opposto non trattato per l'uso come controllo interno.
