Isolamento delle fibrille amiloidi dall'estratto di tessuto cerebrale

Abstract

Fonte: Upadhyay, A. et al., Purificazione biochimica e caratterizzazione proteomica dei nuclei di fibrille amiloidi dal cervello. J. Vis. Exp. (2022)

Questo video mostra il protocollo per isolare le fibrille amiloidi dall'estratto di tessuto cerebrale di topo utilizzando la centrifugazione in gradiente di densità e la digestione di proteine non amiloidi.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Prelievo di tessuti e purificazione dell'amiloide

NOTA: Idealmente, le fibrille amiloidi dovrebbero essere isolate da regioni cerebrali appena sezionate. Tuttavia, questo metodo funziona bene anche con tessuti cerebrali congelati a scatto o a scatto. Di seguito è riportata una breve descrizione dei tessuti cerebrali congelati a scatto per la conservazione per l'uso in un secondo momento.

1. Raccolta e conservazione del tessuto cerebrale: sezionare i cervelli dei topi e raccogliere rapidamente le regioni cariche di amiloide (cioè corteccia e ippocampo), seguite dal congelamento rapido in azoto liquido o in un bagno di alcol con ghiaccio secco><. nota: Il congelamento rapido aiuta a preservare gli attributi strutturali dei costituenti del tessuto. I topi vengono soppressi mediante isoflurano e lussazione cervicale. Si consiglia di evitare l'uso di CO₂ poiché ciò può compromettere l'integrità del proteoma cerebrale.
2. Dopo la dissezione, tagliare e conservare i tessuti freschi in piccoli blocchi (ad esempio, 5 mm x 5 mm), in quanto ciò facilita un'omogeneizzazione più efficiente prima dell'estrazione dell'amiloide. Trasferire il fazzoletto nella fiala criogenica sterile, stringere il tappo e immergerlo rapidamente.
3. Mantenere i tessuti congelati in condizioni di ultrafreddo (ad esempio, -80 °C o azoto liquido). Se l'estrazione deve essere eseguita qualche giorno dopo, conservare i tessuti a -20 °C ed evitare cicli di gelo e disgelo. Scongelare i tessuti congelati su ghiaccio umido quando sono pronti per l'estrazione e la purificazione.
   nota: Il contatto diretto dei tessuti con l'azoto liquido può causare danni ai tessuti e alle proteine. Si noti che un bagno alcolico può rimuovere i pennarelli indelebili dalle etichette delle provette.

2. Arricchimento di materiale insolubile di sodio dodecil solfato (SDS)

NOTA: Eseguire tutti i passaggi su ghiaccio e centrifugare a 4 °C, se non diversamente specificato. I produttori e i numeri di catalogo dei prodotti chimici e degli strumenti sono riportati nella Tabella dei materiali.

1. Iniziare con regioni di tessuto cerebrale appena sezionate o congelate a scatto (scongelate con ghiaccio) poste in una provetta da 2 ml contenente 6-8 perle di ceramica e un tampone di omogeneizzazione ghiacciato appena preparato (1 ml per 0,25-1 g di massa di tessuto umido).
2. Trasferire le provette nell'omogeneizzatore a microsfere e macinare il contenuto del tessuto a 4000 giri/min, con due cicli di 30 s ciascuno e un intervallo di 30 s tra l'uno e l'altro.
   nota: In alternativa, è possibile utilizzare sistemi di agitazione o omogeneizzatore motorizzati per macinare e omogeneizzare i tessuti.
3. Aggiungere 9 mL di tampone di omogeneizzazione ghiacciato a 1 mL di omogeneizzato di tessuto intero cerebrale in provette da 15 mL, sigillare con strisce di pellicola di cera da laboratorio e ruotare end-to-end durante la notte a 4 °C per garantire una solubilizzazione robusta.
   nota: Per rimuovere i detriti cellulari di grandi dimensioni e i lipidi indesiderati, la mattina successiva, centrifugare le provette a 800 x g a 4 °C per 10 minuti e raccogliere il surnatante in una provetta nuova. Risospendere il pellet rimanente in 2 mL di tampone di omogeneizzazione ghiacciato, mescolare bene, centrifugare di nuovo per 10 minuti a 4 °C e combinare i due surnatanti.
4. Aggiungere lentamente il saccarosio solido alla sospensione di estratto tissutale fino a una concentrazione finale di 1,2 M, mescolare bene e centrifugare a 250.000 x g per 45 minuti a 4 °C.
5. Rimuovere con cautela ed eliminare il surnatante utilizzando una pipetta. Triturare il pellet in 2 mL di tampone di omogeneizzazione contenente 1,9 M di saccarosio, quindi centrifugare a 125.000 x g per 45 minuti a 4 °C.
   nota: Il volume del tampone può essere regolato in base alla quantità di materiale recuperato dal passaggio precedente. In generale, 10 volumi di tampone di omogeneizzazione (V/V) sono l'ideale per questa fase.
6. Raccogliere lo strato solido bianco superiore utilizzando una pipetta, trasferirlo in una provetta nuova e solubilizzare in 1 mL di tampone di lavaggio ghiacciato pipettando su e giù più volte, senza introdurre bolle d'aria.
7. Oltre allo strato superiore, il pellet è arricchito anche con fibrille amiloidi. Per una resa maggiore, unire le due frazioni e procedere. Rimuovere con cautela lo strato acquoso intermedio utilizzando una pipetta e gettarlo.
8. Centrifugare le frazioni combinate a 8000 x g per 20 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante.
9. Aggiungere 1 mL di tampone di digestione ghiacciato al pellet lavato, risospendere e incubare a temperatura ambiente (RT) per 3 ore.
10. Centrifugare a 8000 x g per 20 min a 4 °C e rimuovere il surnatante utilizzando una pipetta.
11. Risospendere e lavare (come al punto 2.8) il pellet digerito due volte in 1 mL di tampone Tris ghiacciato.
12. Risospendere il pellet lavato in 1 mL di tampone di solubilizzazione contenente l'1% di SDS e 1,3 M di saccarosio pipettando su e giù. Centrifugare rapidamente a 200.000 x g per 60 minuti a 4 °C.
    nota: Sebbene le fibrille amiloidi siano altamente resistenti ai detergenti e ai denaturanti, esposizioni molto lunghe al detergente (1% SDS) possono compromettere l'integrità delle fibrille o rimuovere le proteine strettamente legate, compromettendo le analisi successive. Pertanto, subito dopo aver risospeso il pellet, procedere alla centrifugazione.
13. Conservare il pellet e aumentare il volume del surnatante rimanente aggiungendo 50 mM di tampone Tris (in rapporto 1:0,3) per ridurre la concentrazione di saccarosio da 1,3 a 1 M e centrifugare ancora una volta a 200.000 x g per 45 minuti a 4 °C.
14. Sciogliere i due pellet in 100 μl di tampone Tris contenente lo 0,5% di SDS e raggruppare per la purificazione dell'amiloide. I pellet visibili sono piccoli e dovrebbero apparire opachi e di colore bianco sporco (vedere la Figura 1A).

Risultati

Figura 1: Conferma dell'estrazione dell'amiloide mediante colorazione biochimica e imaging delle fibrille amiloidi. (A) Il pellet insolubile SDS arricchito contenente amiloide appare di colore bianco sporco opaco. (B) colorazione con rosso Congo del surnatante solubile SDS e del pellet insolubile SDS contenente amiloide purificata tamponata su membrana di nitrocellul...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Inibizione della proteasi	Termo Scientifico	164535	È possibile utilizzare strumenti alternativi, sostanze chimiche e anticorpi di altri produttori
cloruro di calcio	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale C1016	È possibile utilizzare strumenti alternativi, sostanze chimiche e anticorpi di altri produttori
Collagenasi	Sigma-Aldrich	Codice: C0130	È possibile utilizzare strumenti alternativi, sostanze chimiche e anticorpi di altri produttori
Cocktail completo di inibitori della proteasi	Sigma-Aldrich	11697498001	È possibile utilizzare strumenti alternativi, sostanze chimiche e anticorpi di altri produttori
Dnase I	Thermo Fisher Scientifico	EN0521	È possibile utilizzare strumenti alternativi, sostanze chimiche e anticorpi di altri produttori
Motore del sistema di omogeneizzazione tissutale K54	Cole Parmer	Glas-Col 099C	È possibile utilizzare strumenti alternativi, sostanze chimiche e anticorpi di altri produttori
Ultracentrifuga Optima L-90K	Beckman Coulter	BR-8101P-E	È possibile utilizzare strumenti alternativi, sostanze chimiche e anticorpi di altri produttori
Omogeneizzatore tissutale Precellys 24	Bertin Strumenti	P000062-PEVO0-A	È possibile utilizzare strumenti alternativi, sostanze chimiche e anticorpi di altri produttori
Dodecil solfato di sodio (SDS)	Sigma-Aldrich	Codice: 74255	È possibile utilizzare strumenti alternativi, sostanze chimiche e anticorpi di altri produttori
Microcentrifuga Sorvall Legend Micro 21R	Thermo Fisher Scientifico	75002446	È possibile utilizzare strumenti alternativi, sostanze chimiche e anticorpi di altri produttori
Tris-HCl	Thermo Fisher Scientifico	15568025	È possibile utilizzare strumenti alternativi, sostanze chimiche e anticorpi di altri produttori