Isolamento delle fibrille amiloidi dall'estratto di tessuto cerebrale

Abstract

Fonte: Upadhyay, A. et al., Purificazione biochimica e caratterizzazione proteomica dei nuclei di fibrille amiloidi dal cervello. J. Vis. Exp. (2022)

Questo video mostra il protocollo per isolare le fibrille amiloidi dall'estratto di tessuto cerebrale di topo utilizzando la centrifugazione in gradiente di densità e la digestione di proteine non amiloidi.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Prelievo di tessuti e purificazione dell'amiloide

NOTA: Idealmente, le fibrille amiloidi dovrebbero essere isolate da regioni cerebrali appena sezionate. Tuttavia, questo metodo funziona bene anche con tessuti cerebrali congelati a scatto o a scatto. Di seguito è riportata una breve descrizione dei tessuti cerebrali congelati a scatto per la conservazione per l'uso in un secondo momento.

1. Raccolta e conservazione del tess....

Risultati

Figura 1: Conferma dell'estrazione dell'amiloide mediante colorazione biochimica e imaging delle fibrille amiloidi. (A) Il pellet insolubile SDS arricchito contenente amiloide appare di colore bianco sporco opaco. (B) colorazione con rosso Congo del surnatante solubile SDS e del pellet insolubile SDS contenente amiloide purificata tamponata su membrana di nitrocellul.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Inibizione della proteasi	Termo Scientifico	164535	È possibile utilizzare strumenti alternativi, sostanze chimiche e anticorpi di altri produttori
cloruro di calcio	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale C1016	È possibile utilizzare strumenti alternativi, sostanze chimiche e anticorpi di altri produttori
Collagenasi	Sigma-Aldrich	Codice: C0130	È possibile utilizzare strumenti alternativi, sostanze chimiche e anticorpi di altri produttori
Cocktail completo di inibitori della proteasi	Sigma-Aldrich	11697498001	È possibile utilizzare strumenti alternativi, sostanze chimiche e anticorpi di altri produttori
Dnase I	Thermo Fisher Scientifico	EN0521	È possibile utilizzare strumenti alternativi, sostanze chimiche e anticorpi di altri produttori
Motore del sistema di omogeneizzazione tissutale K54	Cole Parmer	Glas-Col 099C	È possibile utilizzare strumenti alternativi, sostanze chimiche e anticorpi di altri produttori
Ultracentrifuga Optima L-90K	Beckman Coulter	BR-8101P-E	È possibile utilizzare strumenti alternativi, sostanze chimiche e anticorpi di altri produttori
Omogeneizzatore tissutale Precellys 24	Bertin Strumenti	P000062-PEVO0-A	È possibile utilizzare strumenti alternativi, sostanze chimiche e anticorpi di altri produttori
Dodecil solfato di sodio (SDS)	Sigma-Aldrich	Codice: 74255	È possibile utilizzare strumenti alternativi, sostanze chimiche e anticorpi di altri produttori
Microcentrifuga Sorvall Legend Micro 21R	Thermo Fisher Scientifico	75002446	È possibile utilizzare strumenti alternativi, sostanze chimiche e anticorpi di altri produttori
Tris-HCl	Thermo Fisher Scientifico	15568025	È possibile utilizzare strumenti alternativi, sostanze chimiche e anticorpi di altri produttori