Un'iniezione intracerebroventricolare per analizzare la distribuzione del citomegalovirus murino nel cervello di un topo neonatale

In questo articolo

Abstract

Fonte: Kawasaki, H., et al. Iniezione intracerebroventricolare e intravascolare di particelle virali e microsfere fluorescenti nel cervello neonatale. J. Vis. Exp. (2016).

Questo video dimostra il processo di iniezione intracerebroventricolare per studiare la distribuzione del citomegalovirus murino (MCMV) nel cervello del topo neonatale. L'MCMV, progettato per esprimere una proteina fluorescente verde potenziata (EGFP) per la visibilità, viene iniettato nel ventricolo laterale del cervello di un cucciolo di topo. Il virus iniettato circola attraverso il liquido cerebrospinale, infettando le cellule della regione periventricolare, compresa la zona marginale, il plesso coroideo e la zona subventricolare.

Protocollo

1. Iniezione ICV di MCMV e microsfere fluorescenti in topi neonatali

Mantenere i topi ICR gravidi normali in una struttura a temperatura controllata con un ciclo luce/buio di 12 ore. I neonati sono designati come P 0,5 il giorno della nascita.
Sterilizzare una siringa da 10 μl e un ago da 27 G con alcol al 70%.
Caricare la soluzione iniettabile (5 μl) contenente MCMV o microsfere fluorescenti nell'ago tirando con cautela lo stantuffo della siringa.
Trattenere il topo neonatale (P 0,5) mettendo il topo sul ghiaccio per 3 - 4 minuti. Una volta che l'animale è sotto anestesia, utilizzare il metodo di risposta con pizzico delle dita dei piedi per determinare la profondità dell'anestesia.
Contrassegnare il sito di iniezione con una penna da laboratorio non tossica in una posizione a circa 0,7 - 1,0 mm lateralmente alla sutura sagittale e a 0,7 - 1,0 mm caudale dalla bregma neonatale (Figura 1A).
Inserire l'ago a 2 mm di profondità, perpendicolare alla superficie del cranio nel sito di iniezione contrassegnato. Per riferimento, segnare a 2 mm dalla punta dell'ago con un produttore non tossico.
Iniettare lentamente 5 μl di MCMV (circa 5 × 10⁵ PFU) nel ventricolo laterale senza aprire il cuoio capelluto (Figura 1B).
In un altro gruppo di topi, iniettare una soluzione da 5 μl contenente microsfere fluorescenti (0,1 - 0,3 μm, circa 5,75 × 10⁸particelle) con lo stesso metodo.
Rimuovere lentamente l'ago 10 - 20 secondi dopo aver interrotto il movimento dello stantuffo per evitare il riflusso.
Per riprendersi, tenere i topi per 5-10 minuti in un contenitore caldo fino a quando il movimento e la reattività generale non vengono ripristinati.
Prelevare il cervello in un intervallo di tempo (3, 12, 24, 48 e 72 ore) dopo l'iniezione.

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Risultati

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Figura 1: Siti di iniezione del topo neonatale. (A, B) Iniezione ICV di 5 μl di MCMV (circa 5 × 10⁵ PFU) o di 5 μl di microsfere (circa 5,75 × 10⁹ particelle). (A) Il sito di iniezione si trova nel punto medio tra l'orecchio e l'occhio (in una posizione di circa 0,7 - 1,0 mm lateralmente alla sutura sagittale e 0,7 - 1,0 mm caudale dalla bregma neonatale).