Valutazione della risposta interneuronale ai segnali chemioattrattivi delle cellule endoteliali periventricolari

Abstract

Fonte: Datta, D., et al. Saggi di migrazione, chemio-attrazione e co-coltura per cellule endoteliali derivate da cellule staminali umane e neuroni GABAergici. J. Vis. Exp. (2020).

Questo video mostra un metodo per testare la migrazione degli interneuroni in risposta a segnali chemioattraenti da cellule endoteliali periventricolari (PVEC). Gli interneuroni sono collocati in un compartimento centrale, con PVEC e cellule di controllo su entrambi i lati. L'aumento della migrazione verso i PVEC indica una risposta positiva ai loro segnali chemioattraenti.

Protocollo

1. Saggio di chemio-attrazione

1. Posizionare un inserto di coltura a tre pozzetti al centro di una piastra da 35 mm rivestita di poli-L-ornitina/laminina utilizzando una pinzetta sterile.
2. Capovolgere il piatto. Segna il confine intorno allo scomparto centrale dell'inserto utilizzando un pennarello nero indelebile con una punta ultrasottile.
3. Seminare 3 x 10⁴ interneuroni GABAergici umani nel compartimento centrale in 70 μL di mezzo neuronale (Figura 1A).
4. Seminare 10⁴ cellule endoteliali periventricolari umane in 70 μL di terreno di cellule endoteliali periventricolari e 10⁴ cellule endoteliali di controllo in 70 μL di terreno di cellule endoteliali di controllo nei due compartimenti esterni, rispettivamente (Figura 1A).
5. Aggiungere 1 mL di terreno di co-coltura (50% terreno di mantenimento periventricolare senza GABA e 50% terreno neuronale) lungo il lato della piastra per evitare che il rivestimento della piastra si asciughi.
6. Controllare al microscopio per verificare che le cellule non perdano dallo scomparto dell'inserto.
7. Incubare le cellule per 24 ore a 37 °C e 5% di CO₂. Dopo 24 ore di incubazione, controllare al microscopio per verificare che le cellule si siano attaccate correttamente e che non vi siano perdite.
8. Dopo 48 ore di semina, rimuovere delicatamente l'inserto utilizzando una pinzetta sterile. Controllare al microscopio per verificare che lo strato cellulare non sia disturbato (giorno 0).
9. Rimuovere il terreno e aggiungere 1 mL di terreno di co-coltura fresco.
   NOTA: Mettere da parte un numero richiesto di piatti per le immagini del giorno 0.
10. Incubare le cellule per 36 ore a 37 °C e 5% di CO₂. Dopo 36 ore, aspirare il terreno, fissare le celle con PFA al 4% per 10 minuti e lavare 3 volte con 1 PBS.
11. Colorare gli interneuroni GABAergici umani con anticorpi anti-tubulina β-umana o anti-MAP2 umana. Al termine della procedura di colorazione, aggiungere 1 ml di terreno di montaggio antisbiadimento a ciascun piatto.

2. Imaging e analisi dei dati

1. Posizionare la piastra del test immunocolorata al microscopio con un ingrandimento 4X.
2. Mantenere un bordo lungo del contorno rettangolare (realizzato nel passaggio 5.10 sopra) nel campo visivo. Scattare immagini di celle nello spazio libero da celle adiacente a tale confine. Acquisire immagini lungo il bordo lungo destro e il bordo lungo sinistro del contorno rettangolare.
   NOTA: Le celle posizionate diagonalmente rispetto al rettangolo non vengono considerate a causa dell'ambiguità nella selezione del lato corto o lungo come segno di partenza. Inoltre, il numero di cellule che migrano attraverso il fronte corto è spesso significativamente inferiore (probabilmente a causa del minor numero di celle iniziali lungo il lato corto) e non viene considerato.
3. Aprire le immagini in ImageJ. Calcolate la distanza tra ogni cella e il segno di confine utilizzando ImageJ.
4. Per valutare la migrazione in termini di numero di celle, impostare una distanza specifica dal confine nell'immagine acquisita in ImageJ. Conta il numero di celle presenti entro questa distanza. Calcola il numero medio, devia standard
5. e la significatività statistica utilizzando un software appropriato.

Risultati

Figura 1: Saggio di chemio-attrazione. (A) Schema del saggio di chemio-attrazione. Utilizzando un inserto di coltura a tre pozzetti, gli interneuroni (IN) sono stati seminati al centro (rettangolo punteggiato verde), mentre le cellule endoteliali periventricolari (EC PV; rettangolo punteggiato arancione) e le cellule endoteliali di controllo (EC; rettangolo punteggiato giallo) sono state seminate su ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Controllo delle cellule endoteliali umane	Dinamica cellulare	R1022
Integratore di Mezzo per il Controllo delle Cellule Endoteliali	Dinamica cellulare	Motore M1019
DMEMF/12 medio	Thermofisher Scientifico	11320033
E6 medio	Thermofisher Scientifico	A1516401
FGF2	Thermofisher Scientifico	PHG0261
Fibronectina	Thermofisher Scientifico	Codice 33016-015
GABA	Sigma-Aldrich	Codice: A2129
Emocitometro	Sigma-Aldrich	Z359629
Neuroni GABAergici umani	Dinamica cellulare	R1013
Terreno di base dei neuroni GABAergici umani	Dinamica cellulare	Motore M1010
Integratore neurale per neuroni GABAergici umani	Dinamica cellulare	Motore M1032
Laminina	sigma	L2020
Supporto di montaggio	Laboratori vettoriali	H-1200
poli-L-ornitina	sigma	p4957
Pbs	Thermofisher Scientifico	Codice: 14190
VEGF-A	Peprotech	100-20
VascuLife VEGF Medium Kit Completo	Tecnologie delle celle Lifeline	LL-0003	Componente del mezzo di controllo delle cellule endoteliali umane
Inserto di coltura in silicone a 3 pozzetti	ibidi	Codice 80369
Piatto da 35 mm	Corning	430165
Soluzione di PFA al 4%	Fisher Scientifico	AAJ19943K2
Microscopio a contrasto di fase invertito	Zeiss	Zeiss Axiovert 40C
Microscopio a fluorescenza	Olimpo	FSX-100
Anticorpo anti-β-tubulina umana	Bioleggenda	802001
Anticorpo anti-MAP2	Neuromica	CH22103