Immunoprecipitazione di complessi proteina-DNA bersaglio dal lisato del motoneurone

Abstract

Fonte: Montanera, K. N. et al., Rhee, H. S. Mappatura ad alta risoluzione delle interazioni proteina-DNA nei neuroni derivati da cellule staminali di topo utilizzando l'immunoprecipitazione della cromatina-esonucleasi (ChIP-Exo). J. Vis. Exp. (2020)

Questo video dimostra l'immunoprecipitazione di frammenti di DNA reticolati con proteine bersaglio da lisati di motoneuroni derivati da cellule staminali utilizzando perle magnetiche rivestite di anticorpi specifici per proteine bersaglio.

Protocollo

NOTA: L'acqua distillata e deionizzata autoclavata (ddH₂O) è consigliata per la preparazione di tamponi e miscele master di reazione.

1. Raccolta e reticolazione delle celle

1. Dopo aver differenziato le cellule staminali embrionali di topo (ES) in neuroni postmitotici, aggiungere l'11% di formaldeide alle cellule raccolte fino a una concentrazione finale dell'1% (v/v). Celle di roccia su una piattaforma oscillante (un bilanciere, un agitatore o un rotatore) per 15 minuti, a temperatura ambiente (RT, 25 °C).
   nota: A seconda della proteina bersaglio da reticolare, è possibile utilizzare una minore reticolazione della formaldeide (ad esempio, una concentrazione finale dello 0,5%) o una doppia reticolazione con disuccinimmidil glutarato (DSG).
2. Aggiungere 2,5 M di glicina a una concentrazione finale di 150 mM per arrestare la reazione di reticolazione. Celle di roccia su una piattaforma a dondolo a RT, per 5 min.
3. Centrifugare le cellule reticolate in provette coniche da 15 mL a RT, per 6 minuti, a 1.350 x g. Aspirare la soluzione, quindi risospendere le cellule in 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
   nota: I pellet di celle reticolate possono essere conservati a -80 °C dopo il congelamento rapido con azoto liquido.

2. Lisi cellulare

NOTA: I seguenti passaggi in questo protocollo sono per circa 2 x 10⁷ cellule neuronali differenziate dalle cellule ES di topo. Per rompere le celle aperte, verranno utilizzati tamponi di lisi contenenti vari detergenti. Aggiungere 50 μL di inibitore completo della proteasi (CPI) 1000x a 50 mL di tampone appena prima dell'uso.

1. Preparare i tamponi di lisi 1−3 come descritto nella Tabella 1.
2. Scongelare i pellet cellulari reticolati con ghiaccio, quindi risospendere accuratamente i pellet cellulari in 3 mL di tampone di lisi 1 in provette coniche da 15 mL. Oscillare a 4 °C per 15 minuti su una piattaforma a dondolo. Centrifugare a 1.350 x g per 5 minuti a 4 °C e aspirare il surnatante.
3. Risospendere accuratamente le cellule pellettate in 3 mL di tampone di lisi 2. Oscillare a 4 °C per 10 minuti su una piattaforma a dondolo. Centrifugare a 1.350 x g per 5 minuti a 4 °C e aspirare il surnatante.
4. Aggiungere 1 mL di tampone di lisi 3 a ciascun pellet, quindi mantenere in ghiaccio. Procedere immediatamente alla sonicazione.

3. Cromatina sonica

NOTA: Mantenere i campioni su ghiaccio o a 4 °C durante questa procedura di sonicazione per ridurre l'inversione della reticolazione.

1. Utilizzando una spatola sterile, aggiungere le perle di sonicazione (Tabella dei materiali) fino al segno di graduazione di 0,2 mL su provette di polistirene da 15 mL. Lavare le perle di sonicazione agitando a vortice in 600 μl di 1x PBS fino a quando non sono visibili punti asciutti. Centrifugare le provette per 5 s a 30 x g e aspirare 1x PBS.
   nota: La sonicazione in tubi di polistirene è più efficiente di quella in tubi di polipropilene. Se un numero inferiore di celle (ad esempio, <10⁶ celle) viene sonicato, utilizzare provette di polistirene da 1,5 ml senza aggiungere perline di sonicazione.
2. Risospendere accuratamente i lisati nucleari in 1 mL di tampone di lisi 3 (dal passaggio 2.4), quindi trasferirli nelle provette di polistirene da 15 mL contenenti microsfere di sonicazione. Agitare brevemente i tubi di polistirolo.
3. Per frammentare il DNA della cromatina reticolata, sonicare lisati nucleari a 4 °C per un numero ottimizzato di cicli, con ampiezza di potenza a 30 W e cicli di sonicazione impostati a 30 s on/30 s off.
   nota: L'ottimizzazione della sonicazione per ogni tipo di cellula e lotto si tradurrà nella migliore resa di immunoprecipitazione-esonucleasi della cromatina (ChIP-exo). Per 2 x 10⁷ cellule neuronali di topo, 20-30 cicli di sonicazione alle impostazioni menzionate frammenteranno la cromatina nell'intervallo 100-500 bp.
4. Al termine della sonicazione, trasferire tutto il surnatante (lisati sonicati) da ciascun campione in provette da 1,5 mL. Aggiungere il 10% di 2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-il)fenossi]etanolo) a ciascun campione a una concentrazione finale dell'1%. Miscelare mediante pipettaggio.
Per pellettare
5. i detriti delle celle, centrifugare i campioni a 13.500 x g per 10 minuti a 4 °C. Trasferire tutti i lisati sonicati (surnatante) da ciascun campione in nuove provette da 1,5 mL.
6. Prelevare 30 μL di lisato sonicato da ciascun campione (~3% di lisato sonicato) e aggiungerli a nuove provette da 1,5 mL per controllare la sonicazione. Conservare i lisati sonicati rimanenti a 4 °C fino al momento dell'incubazione con perle rivestite di anticorpi.

4. Controllo della sonicazione

1. Preparare 20 mL di tampone K 2x proteinasi aggiungendo 2 mL di Tris-HCl 0,5 M (pH 8,0), 2 mL di acido etilendiammina tetraacetico 0,5 M (EDTA), 10 mL di dodecil solfato di sodio al 10% (SDS) e 6 mL di ddH₂O autoclavato. Non aggiungere CPI a questo buffer. Conservare in provetta da 50 mL presso RT.
2. Per invertire la reticolazione proteina-DNA, rimuovendo le proteine, prelevare i 30 μL di cromatina sonicata da ciascun campione (dal passaggio 3.6), aggiungere 166 μL di ddH₂O autoclavato, 200 μL di tampone K proteinasi 2x e 4 μL di proteinasi K 20 mg/mL. Agitare brevemente i campioni, quindi incubare a 65 °C per 1-3 ore a 24 x g.
3. NOTA: I lisati sonicati possono essere reticolati inversamente a 65 °C durante la notte.
4. Estrarre il DNA utilizzando fenolo:cloroformio:alcol isoamilico (PCIA: 25:24:1) e metodo di precipitazione dell'etanolo come segue.
   cautela: La PCIA è tossica. Utilizzare sotto cappa aspirante con dispositivi di protezione individuale (DPI) standard.
   1. Aggiungere 400 μl di PCIA a ciascun campione in provette da 1,5 mL, impostare il vortice alla massima velocità e i campioni a vortice per 20 s. Centrifugare a 18.400 x g per 6 minuti a RT. Si osserveranno due fasi. Trasferire con cautela lo strato acquoso superiore (fase trasparente) di ciascun campione in nuove provette da 1,5 mL.
   2. Aggiungere 1 μL di 10 mg/mL di RNasi A. Incubare i campioni a 37 °C per 30 minuti.
   3. Aggiungere 1 μL di 20 mg/mL di glicogeno a ciascun campione, quindi precipitare con 1 mL di etanolo ghiacciato al 100% (conservato in un congelatore a -20 °C). Mescolare brevemente, quindi incubare i campioni in congelatore a -80 °C per 30 minuti - 1 ora. Centrifugare i campioni a 18.400 x g per 10 minuti a 4 °C e versare con cura etanolo al 100%.
   4. Lavare i pellet con 500 μL di etanolo ghiacciato al 70% (conservato in un congelatore a -20 °C). Centrifugare a 18.400 x g per 5 minuti a 4 °C. Versare con cura il 70% di etanolo.
   5. Incubare i campioni in provette da 1,5 mL a 50 °C fino a quando l'etanolo rimanente non è evaporato. Risospendere i pellet di DNA in 15 μL di ddH2O autoclavato o ddH2O privo di nucleasi.
   6. Eseguire i campioni di DNA estratti, insieme a una scala di DNA, in un gel di agarosio all'1,5% a 120-180 V e controllare le dimensioni del DNA sonicato.

5. Incubazione di anticorpi con perle

NOTA: I seguenti passaggi in questo protocollo sono per circa 2 x 10⁷ cellule neuronali differenziate dalle cellule ES di topo. Non congelare e scongelare le microsfere magnetiche in nessun momento durante il protocollo ChIP-exo, poiché le microsfere potrebbero rompersi causando la contaminazione del campione o le prestazioni dell'anticorpo potrebbero essere compromesse.

1. Dopo la lisi cellulare e la sonicazione, preparare le microsfere magnetiche di proteina G (tabella dei materiali) per ChIP, mescolare le microsfere magnetiche fino a renderle omogenee, quindi aggiungere 25 μL di microsfere magnetiche a 2 mL di provette a basso legame proteico.
   NOTA: Il tipo di biglie magnetiche utilizzate dipenderà dalla specie degli anticorpi.
2. Lavare le perle con 1 mL di soluzione bloccante (Tabella 1), mescolare bene, quindi posizionarle su una griglia magnetica per 1 minuto. Mentre è ancora su una rastrelliera magnetica, rimuovere il surnatante una volta che è trasparente.
3. Aggiungere 1 mL di soluzione bloccante alle microsfere magnetiche. Tubi di roccia per 10 minuti a 4 °C su una piattaforma a dondolo. Centrifugare brevemente, quindi posizionare le provette su una rastrelliera magnetica e rimuovere il surnatante.
4. Ripetere il passaggio 5.3 altre due volte.
5. Aggiungere 500 μl di soluzione bloccante alle microsfere magnetiche. Far ruotare brevemente l'anticorpo contro Isl1 (0,04 μg/μL, Tabella dei materiali), quindi aggiungere 4 μg di anticorpo alle corrispondenti provette a basso legame proteico da 2 mL contenenti le microsfere magnetiche in soluzione bloccante.
6. Ripetere il passaggio 5.5 senza anticorpi (cioè il controllo senza anticorpi per ChIP).
   nota: La quantità di anticorpo da aggiungere può essere determinata empiricamente considerando la qualità dell'anticorpo e il numero di cellule utilizzate per ChIP.
7. Campioni di roccia a 4 °C per 6-24 ore su una piattaforma oscillante.

6. Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP)

1. Lavare le perle rivestite di anticorpi dal passaggio 5.8 con 1 mL di soluzione bloccante. Posizionare i campioni su una piattaforma oscillante a 4 °C per 5 minuti. Rimuovere il surnatante.
2. Ripetere il passaggio 6.1 altre due volte.
3. Risospendere le perle rivestite di anticorpi in 50 μL di soluzione bloccante, quindi trasferirle in nuove provette da 2 mL di proteine a basso legame. Per ogni campione di ChIP, aggiungere lisati sonicati (~1,0 mL dal passaggio 3.6) a perle rivestite di anticorpi in provette a basso legame proteico da 2 mL.
4. Incubare ogni campione su una piattaforma oscillante per una notte a 4 °C.

7. Lavaggi ChIP

NOTA: Conservare i campioni su ghiaccio o a 4 °C per mantenere la reticolazione proteina-DNA durante i lavaggi ChIP.

1. Preparare un tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale, un tampone di lavaggio LiCl e un tampone Tris-HCl da 10 mM (pH 7,4) come descritto nella Tabella 2. Conservare in provette da 50 ml a 4 °C. Aggiungere 50 μl di stock 1000x CPI a tutti i tamponi appena prima dell'uso.
2. Centrifugare brevemente i campioni in provette da 2 mL di proteine a basso legame per raccogliere il liquido dai tappi, quindi posizionarli su una griglia magnetica per 1 minuto e rimuovere accuratamente il surnatante con una pipetta.
3. Per i lavaggi ChIP, aggiungere 1 mL di tampone di lisi 3 (a 4 °C) in ciascuna provetta. Mescolare su una piattaforma a dondolo a 4 °C per 5 minuti. Centrifugare brevemente i campioni, quindi posizionarli su una griglia magnetica per 1 minuto e rimuovere il surnatante con una pipetta.
4. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio freddo ad alto contenuto di sale in ciascuna provetta. Mescolare su una piattaforma a dondolo a 4 °C per 5 minuti. Centrifugare brevemente i campioni, quindi posizionarli su una griglia magnetica per 1 minuto e rimuovere il surnatante con una pipetta.
5. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio LiCl freddo in ciascuna provetta. Mescolare su una piattaforma a dondolo a 4 °C per 5 minuti. Centrifugare brevemente i campioni, quindi posizionarli su una griglia magnetica per 1 minuto e rimuovere il surnatante con una pipetta.
6. Aggiungere 1 mL di tampone Tris-HCl freddo da 10 mM (pH 7,4) a ciascuna provetta. Mescolare su una piattaforma a dondolo a 4 °C per 5 minuti. Centrifugare brevemente i campioni, quindi posizionarli su una griglia magnetica per 1 minuto e rimuovere il surnatante con una pipetta.
   nota: Il tampone Tris-EDTA (pH 8,0) può essere utilizzato al posto del tampone Tris-HCl (pH 7,4).

Tabella 1: Ricette per tamponi di lisi 1−3 e tampone di blocco. Conservare in provette da 50 ml a 4 °C. Aggiungere 50 μl di stock 1000x CPI (inibitore completo della proteasi) a tutti i tamponi appena prima dell'uso.

Tampone di lisi 1
Reagente	Volume (mL)	[Finale]
1 M HEPES (pH 7,3)	2.5	50 mM
5 M NaCl	1.4	140 mM
0,5 M EDTA (pH 8,0)	0,1	1 mM
50% Glicerolo	10	10%
10% ottilfenolo etossilato	2.5	0,50%
10% 2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-il)fenossi]etanolo	1.25	0,25%
Autoclavato ddH2O	Riempi fino a 50
Tampone di lisi 2
Reagente	Volume (mL)	[Finale]
0,5 M Tris-HCl (pH 8,0)	1	10 mM
5 M NaCl	numero arabo	200 mM
0,5 M EDTA (pH 8,0)	0,1	1 mM
Autoclavato ddH2O	Riempi fino a 50
Tampone di lisi 3
Reagente	Volume (mL)	[Finale]
1 M Tris-HCl (pH 8,0)	0,5	10 mM
5 M NaCl	1	100 mM
0,5 M EDTA (pH 8,0)	0,1	1 mM
10% Acido desossicolico	0,5	0,10%
Soluzione di sale sodico di N-lauroilsarcosina al 30%	0,83	0,50%
Autoclavato ddH2O	Riempi fino a 50
Soluzione bloccante
Reagente	importo	[Finale]
Albumina sierica bovina (BSA)	250 mg	0,50%
Inibitore completo della proteasi (CPI, 1000x)	50 μl	1x
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Riempire fino a 50 mL

Tabella 2: Ricette per lavaggi ChIP: tampone High Salt Wash, tampone LiCl Wash e 10 mM di tampone Tris-HCl (pH 7.4). Conservare in provette da 50 ml a 4 °C. Aggiungere 50 μl di stock 1000x CPI a tutti i tamponi appena prima dell'uso.

Tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale
Reagente	Volume (mL)	[Finale]
1 M HEPES (pH 7,3)	2.5	50 mM
5 M NaCl	5	500 mM
0,5 M EDTA (pH 8,0)	0,1	1 mM
10% 2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-il)fenossi]etanolo	5	1%
5% Acido desossicolico	1	0,10%
5% SDS	1	0,10%
Autoclavato ddH2O	Riempi fino a 50
LiCl tampone di lavaggio
Reagente	Volume (mL)	[Finale]
0,5 M Tris-HCl (pH 8,0)	numero arabo	20 mM
0,5 M EDTA (pH 8,0)	0,1	1 mM
1 M LiCl	12.5	250 mM
10% ottilfenolo etossilato	2.5	0,50%
5% Acido desossicolico	5	0,50%
Autoclavato ddH2O	Riempi fino a 50
10 mM Tampone Tris-HCl
Reagente	Volume (mL)	[Finale]
1 M Tris-HCl (pH 7,4)	0,5	10 mM
Autoclavato ddH2O	Riempi fino a 50

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Agarosio, UltraPuro	Invitrogen	Ore 16500	Controllo della sonicazione (Sezione 4.3.6)
Albumina, siero bovino (BSA), senza proteasi, isolamento da shock termico, min. 98%	BioShop	ALB003	Soluzione di blocco
Anticorpo contro Isl1	DSHB	39.3F7	Iniezione di anticorpi con perline (Sezione 5.6)
Bioruptor Pico	Diagenode	B01060010	Cromatina sonicante (Sezione 3.3)
Centrifuga 5424 R	Eppendorf	5404000138	Sonicazione della cromatina (Sezione 3.5), Controllo della sonicazione (Sezione 4.3.1, 4.3.3 e 4.3.4)
Centrifuga 5804 R	Eppendorf	22623508	Celle di raccolta, reticolazione e congelamento (Sezione 1.3), Lisi cellulare (Sezione 2.2 e 2.3), Cromatina sonicante (Sezione 3.1)
Cocktail completo, mini, di inibitori della proteasi senza EDTA	Roche	4693159001	Aggiunto a tutti i tamponi, ad eccezione del tampone proteinasi K e del tampone di eluizione ChIP
Acido desossicolico Sale sodico	Fisher Scientific	BP349	Tampone di lisi 3, tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale e tampone di lavaggio LiCl
EDTA, 0,5 m, soluzione sterile, pH 8,0	BioShop	EDT111	Tampone di lisi 1-3, controllo della sonicazione (Sezione 4.1), tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale, tampone di lavaggio LiCl e tampone di eluizione ChIP
Alcool etilico anidro, 100%	Alcoli commerciali	P006EAAN	Controllo della sonicazione (Sezione 4.3.3)
La formaldeide, 36,5-38%, contiene il 10-15% di metanolo	sigma	F8775	Celle di raccolta, reticolazione e congelamento (sezione 1.1)
Glicerolo, grado di reagente, min 99,5%	BioShop	GLY002	Tampone di lisi 1
Glicina, grado biotecnologico, min. 99%	BioShop	GLN001	Celle di raccolta, reticolazione e congelamento (sezione 1.2)
Glicogeno, grado RNA	Termo Scientifico	R0551	Controllo della sonicazione (Sezione 4.3.3)
HEPES, 1 M Soluzione filtrata sterile, pH 7,3	BioShop	HEP003	Tampone di lisi 1, tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale
Cloruro di litio (LiCl), grado reattivo	Bioshop	LIT704	LiCl Wash Buffer
Sfere magnetiche per ChIP (Dynabeads Protein G)	Dynabeads Protein G (microsfere magnetiche per ChIP)	Dynabeads Protein G (microsfere magnetiche per ChIP)	Incubazione di anticorpi con perle (Sezione 5)
Cremagliera magnetica (magnete DynaMag-2)	Invitrogen	Codice 12321D	Utilizzato in molti passaggi nelle Sezioni: 5
Soluzione di sale sodico di N-lauroilsarcontona, soluzione acquosa al 30%, ≥97,0% (HPLC)	sigma	Codice 61747	Tampone di lisi 3
Ottilfenolo etossilato (IGEPAL CA630)	BioShop	NON999	Tampone di lisi 1 e tampone di lavaggio LiCl
Fenolo:Cloroformio:Alcool isoamilico, grado biotecnologico (25:24:1)	BioShop	PHE512	Controllo della sonicazione (Sezione 4.3.1)
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 1x	Corning	21040CV	Celle di raccolta, reticolazione e congelamento (Sezione 1.3) e cromatina sonicante (Sezione 3.1), Iniezione di anticorpi con perline (Sezione 5.1)
Alimentatore di base PowerPac	BioRad	1645050	Controllo della sonicazione (Sezione 4.3.6)
Soluzione di proteinasi K, grado RNA	Invitrogen	25530049	Controllo della sonicazione (Sezione 4.2)
Senza Rnasi A, Dnasi e proteasi	Termo Scientifico	EN0531	Controllo della sonicazione (Sezione 4.3.2)
Cloruro di sodio (NaCl), BioReagente	sigma	S5886	Tampone di lisi 1-3, tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale
Sodio Dodecil Solfato (SDS), Grado Elettroforesi	BioShop	Scheda SDS001	Controllo della sonicazione (Sezione 4.1), del tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale e del tampone di eluizione ChIP
Perle di sonicazione e provette per bioruptor da 15 mL	Diagenode	C01020031	Cromatina sonicante (Sezione 3.1 e 3.2)
ThermoMixer F1.5	Eppendorf	5384000020	Sezione 4.2, 4.3.2 e 4.3.5
Soluzione di Trizma cloridrato (Tris-HCl), certificato BioPerformance, 1 m, pH 7,4	sigma	T2194	Tampone Tris-HCl da 10 mM
Soluzione di Trizma cloridrato (Tris-HCl), certificata BioPerformance, 1 m, pH 8.0	sigma	T2694	Tampone di lisi 2, tampone di lisi 3, controllo della sonicazione (Sezione 4.1), tampone di lavaggio LiCl e tampone di eluizione ChIP
VWR Mini Tube Rocker, velocità variabile	VWR	Codice 10159-752	Utilizzato in molti passaggi nelle sezioni: 1, 2, 5, 6 e 7
2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-il)fenossi]etanolo, Triton X-100, grado reagente	BioShop	TRX506	Tampone di lisi 1, cromatina sonicante (Sezione 3.4) e tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale