Immunocolorazione a fluorescenza di fette di organoidi cerebellari

Abstract

Fonte: Silva, T. P., et al., Generazione scalabile di organoidi cerebellari maturi da cellule staminali pluripotenti umane e caratterizzazione mediante immunocolorazione. (2020)

Questo video dimostra la colorazione in immunofluorescenza di fette di organoidi cerebellari per identificare specifici antigeni bersaglio espressi in vari neuroni cerebellari, che sono indicativi della maturazione dell'organoide.

Protocollo

1. Immunocolorazione di fette di organoidi

1. Posizionare i vetrini del microscopio contenenti sezioni di organoidi in un barattolo di copertura con 50 ml di PBS 1x preriscaldato, che può contenere fino a 10 vetrini uno dopo l'altro.
   nota: Tutte le sezioni dell'organoide devono essere immerse in un liquido.
2. Incubare per 45 minuti a 37 °C per degelatinizzare i vetrini.
3. Lavare 1 volta con 50 mL di PBS 1× per 5 minuti a RT: trasferire i vetrini in un barattolo contenente 1× PBS fresco.
4. Trasferire i vetrini in un barattolo contenente 50 mL di glicina appena preparata (Tabella 1) e incubare per 10 minuti a RT.
5. Trasferire i vetrini in una baracca contenente 50 mL di tritone allo 0,1% (Tabella 1) e permeabilizzare per 10 minuti a RT.
6. Lavare con 1× PBS per 5 minuti 2x.
7. Preparare la piastra di immunocolorazione con carta da 3 mm imbevuta di PBS 1×. Asciugare i vetrini con un fazzoletto di carta tutto intorno alle fette e posizionarli su carta da 3 mm. Con una pipetta Pasteur, coprire l'intera superficie dei vetrini con una soluzione bloccante (Tabella 1), 0,5 ml per vetrino. Incubare per 30 minuti a RT.
8. Rimuovere la soluzione bloccante in eccesso e asciugare i vetrini con un fazzoletto tutto intorno alle fette. Porre 50 μl dell'anticorpo primario (Tabella 2) diluito in soluzione bloccante sulle sezioni e coprire con i vetrini. Mettere le fette in un piatto di immunocolorazione precedentemente preparato. Incubare per una notte a 4 °C.
9. Trasferire i vetrini in un barattolo con 50 ml di TBST (Tabella 1), lasciare cadere i vetrini coprioggetti e lavare con TBST per 5 minuti 3 volte.
10. Porre 50 μl dell'anticorpo secondario diluito in soluzione bloccante sulle sezioni e coprire con i vetrini. Mettere le fette nella capsula di immunocolorazione precedentemente preparata. Incubare per 30 minuti a RT, al riparo dalla luce.
11. Trasferire nuovamente i vetrini in un barattolo di copertura e lavare con 50 ml di TBST per 5 minuti 3 volte.
12. Asciugare i vetrini con la velina tutt'intorno alle fette e posizionare le fette in una capsula di immunocolorazione precedentemente preparata. Con una pipetta Pasteur, aggiungere 0,5 mL di soluzione DAPI su tutta la superficie dei vetrini. Incubare per 5 minuti a RT.
13. Ripetere il passaggio 1.9.
14. Asciugare accuratamente i vetrini con un fazzoletto. Aggiungere 50 μl di mezzo di montaggio goccia a goccia lungo il vetrino, quindi abbassare con cautela un vetrino coprioggetti su ciascun vetrino, piegandolo leggermente per evitare bolle.

Tabella 1: Soluzioni per la preparazione di organoidi per criosezione e immunocolorazione. Sono elencati tutti i componenti e i volumi utilizzati per preparare le soluzioni utilizzate nella preparazione di organoidi per criosezione e immunocolorazione.

Gelatina/Saccarosio<br /> Concentrazione finale: 7,5%/15% p/p	1. Pesare 15 g di saccarosio e 7,5 g di gelatina in una bottiglia di vetro Schott sterile e mescolare bene 2. Preriscaldare il PBS 1 volta a 65 °C 3. Aggiungere PBS 1x preriscaldato fino a un peso finale di 100 g e mescolare bene 4. Mettere la bottiglia di vetro Schott in una piastra riscaldante a 65 °C e agitare fino a quando la gelatina non si scioglie 5. Incubare a 37 °C fino a quando la soluzione non si stabilizza
Glicina Concentrazione finale: 0,1 M	Aggiungere 0,37 g di glicina a 50 ml di PBS 1x appena preparato.
Soluzione Triton Concentrazione finale: 0,1 % p/v	1. Preparare un brodo Triton X-100 al 10%: 5 g di Triton X-100 in 50 ml di PBS 1x 2. Aggiungere 0,5 mL di stock Triton X-100 a 50 mL di PBS 1x.
TBST 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,05 % p/v Tween-20	20 ml Tris 1 M 30 mL di NaCl 5 M 5 mL di Tween-20 (10 % di brodo: 5 g di Tween-20 in 50 mL di acqua) Riempire fino a 1 L con acqua.
Soluzione di blocco	Aggiungere 5 mL di siero fetale bovino (FBS, concentrazione finale: 10 % v/v) a 50 mL di TBST.
Soluzione DAPI	Aggiungere 15 μL di soluzione madre DAPI (1 mg/mL) a 10 mL di acqua distillata
Mowiol	1. Aggiungere 2,4 g di Mowiol a 6 g di glicerolo e agitare per 1 ora in una piastra preriscaldata a 50 °C 2. Aggiungere 6 ml di acqua distillata e agitare per 2 h 3. Aggiungere 12 mL di Tris 200 mM (pH 8,5) e agitare per 10 min 4. Centrifugare a 5.000 × g per 15 min5. Aliquotare e conservare a -20 °C.

Tabella 2: Anticorpi primari. Vengono elencati gli anticorpi primari, i cloni e le diluizioni ottimizzate utilizzate per l'immunocolorazione.

1

anticorpo	Specie ospiti	diluizione
BARHL1	coniglio	1/500
CALBINDINA	coniglio	1/500
MAP2	topo	1/1000
N-CADHERIN	topo	1/1000
NESTINA	topo	1/400
OLIG2	coniglio	1/500
PAX6	coniglio	1/400
SOX2	topo	1/200
Da definire	coniglio	1/200
TBR2	coniglio	1/200
TUJ1	topo	1/1000

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Carta da 3 mm	WHA3030861	Merck
Anticorpo anti-BARHL1	HPA004809	Anticorpi Atlas
Anticorpo anti-Calbindina D-28k	CB28	Millipore
Anticorpo anti-MAP2	Codice: M4403	sigma
Anticorpo anti-N-caderina	610921	Trasduzione BD
Anticorpo anti-NESTIN	MAB1259-SP	Ricerca e Sviluppo
Anticorpo anti-OLIG2	MABN50	Millipore
Anticorpo anti-PAX6	PRB-278P	Covance
Anticorpo anti-SOX2	MAB2018	Ricerca e Sviluppo
Anticorpo anti-TBR1	AB2261	Millipore
Anticorpo anti-TBR2	ab183991	Abcam
Anticorpo anti-TUJ1	801213	Bioleggenda
Vetrini coprioggetti 24x60mm	631-1575	VWR
DAPI	10236276001	sigma
Siero fetale bovino	A3840001	ThermoFisher
Gelatina proveniente dalla pelle bovina	G9391	sigma
Barattolo di vetro	E94	ThermoFisher
glicina	MB014001	NZYtech
Monotioglicerolo	Codice: M6154	sigma
Mowiol	475904	Millipore	Supporto di montaggio
Triton X-100	9002-93-1	sigma
Interpolazione-20	P1379	sigma
Vetrini per microscopio SuperFrost	12372098	ThermoFisher	Vetrini per microscopio ad adesione