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1. Creazione di organoidi cerebrali da coltura 2D iPSC / hESC (Giorno 0)
Nota: Questo protocollo presuppone che il mantenimento delle cellule staminali (SC) sia condotto in terreni di mantenimento con cellule staminali prive di xeno (SCMM) con un substrato di vitronectina o Geltrex. Se si utilizza un terreno di coltura di cellule staminali alternativo ad alto contenuto proteico, è consigliabile passare da colture SC a SCMM per almeno due passaggi prima di iniziare la formazione di organoidi. Il protocollo non è stato testato con metodi di coltura SC basati su alimentatore.
- Utilizzando metodi di manutenzione SC regolari, portare le colture al 50%-70% di confluenza. Questo avviene in genere 3-4 giorni dopo il passaggio, anche se può dipendere dal metodo di coltura e dalla linea cellulare><.
nota: Sono necessari circa 2 pozzetti da una piastra a 6 pozzetti per produrre una piastra completa di organoidi a 96 pozzetti.
- Ispeziona le colture tramite microscopia in campo chiaro con ingrandimento 10X-20X per garantire una morfologia sana delle colonie, senza differenziazione rilevabile.
- Portare l'SCMM a 37 °C in un bagno di acqua calda e scongelare un flaconcino da 50 μL di 50 mM di Y-27632 (Inibitore della roccia) e 2 mL di reagente di distacco enzimatico a temperatura ambiente.
- Preparare una piastra a 96 pozzetti con fondo a U con attacco ultrabasso (ULA), una pipetta P200 multicanale e un serbatoio di reagenti da 25 mL.
- Aliquotare 45 mL di SCMM in una provetta conica da 50 mL e aggiungere 45 μL di Y-27632 da 50 mM. Mescolare accuratamente triturando.
- Aspirare sotto vuoto i due pozzetti contenenti SC e aggiungere rapidamente 1 mL di reagente di distacco privo di enzimi a ciascun pozzetto utilizzando una pipetta P1000. Incubare la piastra in un'incubatrice a 37 °C per 4 minuti.
- Aspirare sotto vuoto i pozzetti trattati e aggiungere 1 mL di reagente di distacco enzimatico a ciascun pozzetto utilizzando una pipetta P1000.
- Incubare la piastra in un'incubatrice a 37 °C per altri 5 minuti.
- Rimuovere la piastra ed esaminare i pozzetti trattati. Picchiettare delicatamente sulla piastra per rompere le cellule aggregate. Se sono ancora visibili grandi ammassi di cellule, incubare la piastra per altri 2 minuti a 37 °C. Ripetere questo passaggio fino a quando i grappoli non sono più visibili ad occhio nudo.
- Una volta che le cellule sono correttamente dissociate, aggiungere 1 ml di SCMM a ciascun pozzetto per disattivare gli enzimi di dissociazione. Raccogliere i 4 mL di sospensione cellulare in una provetta conica da 50 mL e prelevare una piccola aliquota per il conteggio delle cellule.
- Riportare i pozzetti rimanenti e non trattati nella piastra di manutenzione nell'incubatore a 37 °C.
- Durante il conteggio, centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 minuti.
- Determinare il numero totale di cellule e calcolare la quantità di soluzione SCMM + Y-27632 necessaria per ottenere una sospensione di 60.000 cellule/mL.
- Aspirare con cautela il surnatante sotto vuoto e aggiungere il volume calcolato della soluzione SCMM + Y-27632. Miscelare 5-10 volte con una pipetta da 5 mL, garantendo una sospensione cellulare uniforme.
- Trasferire immediatamente la sospensione cellulare in un serbatoio di reagenti e pipettare 150 μl in ciascun pozzetto della piastra ULA U-bottom a 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale P200. Questo produce 96 organoidi individuali, ciascuno inizialmente costituito da 9.000 cellule.
- Centrifugare la piastra a 150 x g per 1 min.
- Posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 °C e non disturbarla per 48 ore.
2. Mantenimento degli organoidi cerebrali (giorno 2)
- Preparare 17 mL di SCMM con 17 μL di Y-27643 da 50 mM in una provetta conica da 50 mL. Riscaldare la soluzione SCMM + Y-27632 a 37 °C in un bagno di acqua calda.
- Prelevare la piastra dell'organoide dall'incubatore e, utilizzando una pipetta multicanale P200 impostata a 75 μL, aspirare lentamente il terreno dal bordo del pozzetto sulla prima fila. Una volta che il terreno è stato aspirato, espellerlo rapidamente nel pozzetto per sollevare le cellule e gli organoidi sciolti. Ripeti l'operazione per ogni riga.
nota: Questa tecnica, di seguito denominata "dispersione", solleva i detriti cellulari e l'organoide in sospensione. L'organoide affonda rapidamente sul fondo del pozzetto, mentre i detriti più piccoli rimangono in sospensione, permettendone la rimozione con un cambio di terreno. Questo aiuta a evitare che l'organoide rimanga nei detriti cellulari durante la coltura.
- Dopo che tutti i pozzetti sono stati dispersi, attendere 15 s per assicurarsi che gli organoidi siano affondati sul fondo di ciascun pozzetto.
- Aspirare lentamente e con attenzione 75 μl di terreno da ciascun pozzetto utilizzando la pipetta multicanale P200 ed erogare in un serbatoio di scarico.
nota: La maggior parte degli utenti aspira occasionalmente un organoide durante i normali pasticci. Questo può verificarsi circa l'1% delle volte. Si prega di pianificare di conseguenza per garantire che un numero sufficiente di organoidi sopravviva ai punti temporali sperimentali.
- Trasferire la soluzione SCMM + Y-27632 in un serbatoio di reagenti ed erogare 150 μl in ciascun pozzetto dell'organoide utilizzando la pipetta multicanale P200.
- Riposizionare la piastra in un'incubatrice a 37 °C.
3. Mantenimento degli organoidi cerebrali (giorno 3)
- Riscaldare 17 mL di SCMM a 37 °C, questa volta senza Y-27643.
- Con la pipetta multicanale P200 impostata su 100 μL, disperdere tutti i pozzetti della piastra dell'organoide (vedere la fase 2.2). Attendere 15 secondi per assicurarsi che gli organoidi siano affondati sul fondo dei loro pozzetti.
- Preparare un serbatoio di scarico e trasferire l'SCMM riscaldato in un serbatoio di origine.
- Aspirare con cautela 125 μl di terreno da ciascun pozzetto e sostituirlo con 150 μl di SCMM fresco utilizzando la pipetta multicanale P200.
- Riposizionare la piastra in un'incubatrice a 37 °C.
4. Mantenimento degli organoidi cerebrali (Giorno 4+)
Nota: Esegui questa manutenzione regolare a giorni alterni fino all'infezione.
- Prima di iniziare l'alimentazione il giorno 4, preparare il terreno di induzione neurale (NI).
- Scongelare un'aliquota da 250 μL di 2 mg/mL di eparina, insieme a una fiala da 5 mL di integratore 100X N-2. Aggiungere i 250 μL di eparina, 5 mL di 100X N-2 e 5 mL di 100X Minimum Essential Medium-Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA) a 500 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) + GlutaMAX. Filtrare sterile la soluzione miscelata in un filtro da 500 mL.
Nota: Mantenere NI a 4 °C quando non è in uso; L'NI dura fino a due settimane prima che venga preparato il terreno fresco.
- Caldo 17 mL di NI medium a 37 °C.
- Con la pipetta multicanale P200 impostata su 100 μL, disperdere tutti i pozzetti della piastra dell'organoide (vedere la fase 2.2). Attendere 15 secondi per assicurarsi che gli organoidi siano affondati sul fondo dei loro pozzetti.
- Preparare un serbatoio di rifiuti e trasferire l'NI riscaldato in un serbatoio di origine.
- Aspirare con cautela 125 μL di terreno da ciascun pozzetto e sostituirlo con 125 μL di NI fresco utilizzando la pipetta multicanale P200.
- Riposizionare la piastra in un'incubatrice a 37 °C.
5. Infezione da organoidi con virus zika (ZIKV) (~Giorno 24)
NOTA: Dopo circa 3 settimane di differenziazione, ci saranno grandi strutture neuroepiteliali e rosette visibili all'interno dell'organoide che saranno altamente suscettibili all'infezione da ZIKV.
- Portare la soluzione salina bilanciata (EBSS) 1X di Earle, la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e l'NI a 37 °C in un bagno di acqua calda.
- Diluire ZIKV della concentrazione nota in 1X EBSS alla molteplicità dell'infezione bersaglio (MOI).
nota: Si raccomandano titolazioni di diversi MOI per ottenere una risposta alla dose virale. Questo può variare in base al ceppo virale; per ATCC VR-1838 e ATCC VR-1843, i valori MOI tipici variano tra 0,1 e 10).
- Rimuovere con cura tutto il terreno dal pozzetto dell'organoide utilizzando una pipetta P200 a canale singolo. Aggiungere rapidamente 200 μl di PBS 1X a ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale P200 per lavare gli organoidi.
- Rimuovere con cura tutto il terreno dal pozzetto dell'organoide utilizzando una pipetta P200 a canale singolo. Aggiungere rapidamente 50 μL di soluzione 1X EBSS-only (mock infection) o di virus ZIKV al pozzetto e assicurarsi che l'organoide sia completamente sommerso. Ripetere per ogni organoide che deve essere infettato per lo studio.
- Riposizionare la piastra in un'incubatrice a 37 °C per 2 h.
nota: L'incubazione di organoidi finti infetti per questa durata non dovrebbe influire in modo significativo sulla loro crescita rispetto agli organoidi indisturbati.
- Circa 30 minuti prima del completamento dell'incubazione virale, aliquotare 25 mL di NI in una provetta conica da 50 mL e portare a 37 °C in un bagno di acqua calda.
- Al termine dell'esposizione virale, lavare gli organoidi con 200 μl di PBS 1X per ciascun pozzetto, lasciare riposare gli organoidi per 15 s e quindi rimuovere 1X PBS utilizzando una pipetta P200 a canale singolo.
- Aggiungere 200 μl di NI fresco a ciascun pozzetto e rimetterlo nell'incubatore.
- Opzionale: per un punto temporale del giorno 0, gli organoidi possono essere sottoposti a imaging un'ora dopo l'infezione.
- Continuare con la coltura sostituendo 125 μL di NI a giorni alterni utilizzando il metodo di dispersione (vedere il passaggio 4). Assicurarsi di smaltire correttamente i terreni e le punte esauriti, poiché contengono particelle ZIKV infettive.