1. Doppia colorazione FDA-PI e coltura di neuroni di granuli cerebellari (CGN)
- Preparare la soluzione di lavoro fluoresceina diacetato-ioduro di propidio (FDA-PI) aggiungendo 20 μL di soluzione madre FDA (concentrazione finale: 10 μg/mL) e 50 μL di soluzione madre PI (concentrazione finale: 50 μg/mL) in 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Mescolate a vortice e posizionate il tutto sul ghiaccio.
nota: Preparare di fresco la soluzione di lavoro FDA-PI soluzione di lavoro appena prima dell'uso.
- Estrarre la piastra per colture cellulari dall'incubatore. Mettilo sul ghiaccio.
- Aspirare il terreno di coltura e sostituirlo con PBS.
freddo
nota: Il cambio della soluzione deve essere fatto lentamente e con attenzione. Evitare di toccare le cellule con i puntali delle pipette.
- Aspirare il PBS freddo e sostituirlo con FDA-PI freddo (500 μL/pozzetto per piastre per colture cellulari a 12 pozzetti o 1 mL/pozzetto per piastre per colture cellulari a 6 pozzetti). Lasciare in ghiaccio per 5 min.
- Aspirare l'FDA-PI e aggiungere PBS freddo (100 μL/pozzetto per piastre per colture cellulari a 12 pozzetti o 50 μL/pozzetto per piastre per colture cellulari a 6 pozzetti).
nota: Le cellule non devono essere lasciate asciugare durante lo scatto di immagini.
- Scatta immagini utilizzando la microscopia fluorescente. Utilizzare un filtro di eccitazione con una banda passante di 450 - 490 nm. Rileva le emissioni di fluorescenza per FDA e PI rispettivamente a 520 e 620 nm. Nelle stesse condizioni, scattare un'immagine in condizioni di luce normale utilizzando la modalità a contrasto di fase della microscopia fluorescente.
nota: Scatta immagini entro 15 minuti dopo FDA-PI. Il tempo di esposizione è di 100-300 ms e il guadagno analogico è 2,8x.
2. Valutazione della vitalità neuronale
- Per la doppia colorazione FDA-PI, sovrapporre le immagini delle cellule rilevate dopo il filtraggio con diversi filtri di fluorescenza trascinando lo strato positivo FDA sullo strato positivo PI nel software di editor grafico.
- Regola l'opacità del livello positivo alla FDA inserendo "50%" nel campo "Opacità" del pannello "Livelli". Unisci due livelli facendo clic sul pulsante "Unisci visibile" nel menu "Livello". Imposta il contrasto delle immagini sovrapposte inserendo "50" nel campo "Contrasto" sotto "Immagine"| "Adeguamenti" | "Luminosità/Contrasto". Assicurarsi che non vi siano celle doppie positive FDA e PI nelle immagini sovrapposte.
