1. Procedura di fissazione e colorazione con immunofluorescenza
- Utilizzando una pipetta p200, trasferire i cervelli sezionati dal piatto a 9 pozzetti a una provetta per microcentrifuga da 0,5 mL riempita con 0,5 mL di paraformaldeide al 4% diluita in PTN (tampone fosfato di sodio 0,1 M pH 7,2, tensioattivo non ionico allo 0,1%). Almeno 10-15 cervelli dello stesso genotipo possono essere combinati in una provetta per microcentrifuga. Tutte le fasi rimanenti (fino al montaggio dei cervelli sui vetrini) vengono completate in provette da microcentrifuga da 0,5 ml.
cautela: La paraformaldeide (PFA) deve essere maneggiata in una cappa aspirante. I rifiuti PFA devono essere conservati e smaltiti correttamente. Il venti per cento della paraformaldeide acquistata in fiale di vetro può essere aliquotata in provette per microcentrifuga e conservata a -20 °C fino al momento del bisogno.
- All'interno di una cappa aspirante, incubare il cervello in paraformaldeide al 4% per 20 minuti con oscillazione a bassa velocità a temperatura ambiente.
- Dopo la fissazione, lasciare che i cervelli si stabiliscano sul fondo della provetta per microcentrifuga per gravità.
nota: Il cervello può occasionalmente attaccarsi al lato della provetta della microcentrifuga. Se ciò si verifica, di solito è utile ruotare lateralmente il tubo tra l'indice e il pollice o picchiettare delicatamente il tubo sulla panca per favorire l'affondamento del cervello.
- Rimuovere il fissativo utilizzando una pipetta p1000 ed eseguire due lavaggi "rapidi" con 500 μL di PTN, consentendo al cervello di depositarsi sul fondo della provetta per microcentrifuga tra un lavaggio e l'altro. Durante questi lavaggi rapidi, una volta che tutti i cervelli si sono depositati per gravità sul fondo della provetta della microcentrifuga, il PTN può essere immediatamente sostituito con un tampone fresco; Non è richiesto alcun tempo di lavaggio aggiuntivo.
nota: In genere, lasciare un tampone extra nella provetta è preferibile al rischio di rimozione del cervello. Spesso è necessario un attento esame del puntale della pipetta per assicurarsi che nessun cervello sia stato rimosso per errore dal tubo. Se il cervello è stato accidentalmente pipettato nel puntale, erogarlo nuovamente nella provetta della microcentrifuga, attendere che il cervello si stabilizzi e quindi continuare a rimuovere l'eventuale PTN rimanente.
- Dopo l'ultimo lavaggio rapido, utilizzare una pipetta p1000 per eseguire tre lavaggi "lunghi": aggiungere 500 μL di PTN e lavare per 20 minuti a temperatura ambiente su un bilanciere/nutatore. Tutti i futuri lavaggi "lunghi" dovrebbero durare 20 minuti.
nota: I cervelli fissati possono essere conservati per una notte a 4 °C in PTN dopo questi lavaggi.
- Rimuovere l'ultimo lavaggio utilizzando una pipetta p1000 e incubare il cervello su un bilanciere o un nutatore a temperatura ambiente in 0,5 mL di soluzione bloccante [PTN + 5% siero di capra normale (NGS)] per almeno 30 minuti a temperatura ambiente.
- Gli anticorpi secondari di capra saranno utilizzati nelle fasi successive del protocollo. Se vengono utilizzati anticorpi secondari di un'altra specie, il siero normale di quella specie (piuttosto che NGS) deve essere utilizzato nelle soluzioni bloccanti e anticorpali.
- Utilizzando una pipetta p1000, rimuovere la soluzione bloccante e aggiungere l'anticorpo primario diluito in PTN (PTN + 5% NGS + anticorpo primario diluito). Quando si utilizza un anticorpo primario per la prima volta, la diluizione ottimale di tale anticorpo deve essere determinata empiricamente.
nota: Per visualizzare i neuroni del corpo a fungo, vengono tipicamente utilizzati anticorpi che riconoscono Fas2. Questi anticorpi sono disponibili presso la Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) come anticorpo 1D4 e devono essere diluiti 1:20 in PTN + 5% NGS.
- Incubare il cervello in una soluzione di anticorpi primari su un rocker/nutator per 2 - 3 notti a 4 °C.
- Dopo l'incubazione con gli anticorpi primari, lasciare che il cervello si stabilizzi sul fondo della provetta per microcentrifuga e quindi rimuovere la soluzione di anticorpi primari.
- Utilizzando una pipetta p1000, eseguire 2 lavaggi "rapidi" e 3 lavaggi "lunghi" di 20 minuti con 0,5 ml di PTN come descritto sopra nei passaggi 1.4 e 1.5, lasciando che il cervello si depositi per gravità sul fondo della provetta per microcentrifuga tra un lavaggio e l'altro.
- Incubare il cervello per 3 ore a temperatura ambiente con anticorpi secondari marcati in fluorescenza appropriati. Gli anticorpi secondari sono solitamente diluiti in 0,5 mL di PTN + 5% NGS a una concentrazione di 1:200,
nota: Una volta aggiunti gli anticorpi secondari fluorescenti, il cervello deve essere tenuto al buio per il resto dell'esperimento.
- Dopo l'incubazione dell'anticorpo secondario, lasciare che il cervello si stabilizzi sul fondo della provetta della microcentrifuga e rimuovere la soluzione di anticorpi secondari.
- Eseguire 2 lavaggi "rapidi" e 3 lavaggi "lunghi" di 20 minuti con 0,5 ml di PTN come descritto sopra nei passaggi 1.4 e 1.5, lasciando che il cervello si depositi sul fondo della provetta per microcentrifuga tra un lavaggio e l'altro.
- Dopo il terzo lavaggio "lungo" di 20 minuti, utilizzare una pipetta p200 per rimuovere quanto più tampone possibile.
- Aggiungere 75 μl di terreno di montaggio fluorescente anti-sbiadimento al cervello. Pipettare i cervelli e il mezzo di montaggio nella punta della pipetta una volta per mescolare. Non capovolgere la provetta poiché il cervello potrebbe rimanere bloccato sul tappo o sui lati della provetta per microcentrifuga.
nota: Dopo la sospensione dei cervelli nel mezzo di montaggio, i tubi possono essere avvolti in un foglio di alluminio per rallentare la tempra dei fluorofori e conservati a 4 °C per una notte. Se necessario, i cervelli possono essere conservati per diversi giorni a 4 °C, ma l'ideale sarebbe essere montata sui vetrini il prima possibile.
2. Montaggio di cervelli adulti di D. melanogaster su vetrini da microscopio e imaging
- Costruisci una diapositiva "ponte". Posizionare due vetrini coprioggetti "base" a circa 1 cm di distanza l'uno dall'altro su un vetrino caricato positivamente. Assicurarsi che il lato caricato positivamente della guida sia rivolto verso l'alto. Far aderire i vetrini coprioggetti al vetrino con lo smalto per unghie, come mostrato nella Figura 1A. Sigillare i tre bordi esterni di ciascun vetrino coprioggetto di base con smalto per unghie è solitamente utile per garantire che il supporto di montaggio non si muova sotto questi vetrini coprioggetti. Lasciare asciugare completamente lo smalto (10 - 15 min) prima di procedere.
- Posizionare il vetrino sotto lo stereomicroscopio e pipettare la soluzione del terreno di montaggio contenente i cervelli sezionati nello spazio tra i due vetrini. Per fornire più contrasto, è utile manovrare le luci a collo d'oca in modo che siano parallele al piano del banco.
- Rimuovere il supporto di montaggio aggiuntivo dal vetrino utilizzando una pipetta, facendo attenzione a non pipettare il cervello dal vetrino.
- Elimina i supporti di montaggio extra. Ciò consentirà di posizionare il cervello in modo più preciso durante la fase successiva.
- Usando un paio di pinze e lo stereomicroscopio, posizionare il cervello sul vetrino in uno schema a griglia con i lobi antennali rivolti verso l'alto.
- Posizionare un vetrino coprioggetto (il "ponte") sul cervello (Figura 1A). Usa lo smalto per unghie per sigillare i lati del copriponte nel punto in cui entrano in contatto con i vetrini di copertura "base".
- Utilizzando una pipetta p200, riempire lentamente la cavità centrale sotto il ponte con un nuovo mezzo di montaggio (Figura 1B). Posizionare una goccia alla volta sul bordo aperto del vetrino coprioggetti centrale e lasciare che il supporto di montaggio si muova sotto il vetrino coprioggetti del ponte centrale. Continua fino a quando l'intera cavità non è riempita con il supporto di montaggio, quindi sigilla la parte superiore e inferiore con uno smalto trasparente.
- Una volta che lo smalto per unghie è asciutto, fotografare immediatamente i vetrini o conservarli in una scatola per vetrini a tenuta stagna e resistente alla luce a -20 °C.
- Entro una settimana, l'imaging del cervello utilizza un microscopio confocale a scansione laser con laser di eccitazione e cubi filtranti appropriati per gli anticorpi secondari fluorescenti scelti. Le immagini Z-stack dei neuroni del corpo dei funghi sono tipicamente ottenute utilizzando obiettivi 20X o 40X.
