1. Preparazione per la microiniezione
- Prepararsi per l'iniezione tirando i capillari di vetro utilizzando un estrattore per micropipette (vedere Tabella dei materiali), seguendo il protocollo in cinque fasi per l'estrazione del tubo capillare di vetro (Tabella 1).
- Aprire la punta dell'ago (capillari di vetro a parete sottile [3,5 pollici] con filamento, diametro esterno [OD] 1,14 mm) alla dimensione appropriata con un angolo utilizzando una pinza (Figura 1A).
- Riempire l'ago con 0,1 ml di olio minerale per assicurarsi che non ci siano bolle.
- Rimuovere il tappo a vite dell'ago in acciaio dell'apparecchio per microiniezione. Allineare il foro dell'ago di vetro con l'ago in acciaio, quindi serrare il tappo a vite. Montare l'apparecchio per microiniezione con ago caricato in un micromanipolatore (vedi Tabella dei materiali).
- Regolare la posizione dell'apparecchio per microiniezione in modo che il micromanipolatore possa muovere in modo flessibile l'apparecchio al microscopio. Scaricare un certo volume di olio di paraffina per far entrare l'ago d'acciaio nel tubo di vetro capillare.
- Far cadere la soluzione iniettabile (come soluzione salina tamponata con fosfato all'1× (PBS) o 5 mg/mL di LPS) su un vetrino sterilizzato con etanolo al 70% e regolare l'apparecchio per microiniezione in modo che la punta sia inserita nella goccia di liquido. Caricare ~2 μL di soluzione iniettabile nell'ago.
- Impostare il micromanipolatore (impostazioni di regolazione fine su , giù, sinistra e destra) in modo che la punta dell'ago dell'apparecchio per microiniezione si trovi nello stesso campo visivo delle larve ad alto ingrandimento (Figura 1B).
2. Montaggio del pesce zebra per microiniezioni
NOTA: Lo sviluppo del cervello del pesce zebra avviene entro 3 giorni dalla fecondazione (dpf) e matura a 5 dpf con un sistema nervoso centrale ben sviluppato. Pertanto, le larve di 5 dpf sono già adatte per studiare il danno neuronale mediato da LPS e le risposte comportamentali e infiammatorie.
- Iniettare le larve di zebrafish entro circa 30 minuti dal raggiungimento dello stadio di interesse, per mantenere la coerenza dei tempi di iniezione.
- Per anestetizzare le larve di zebrafish, combinare la tricaina con acqua pulita dell'acquario (concentrazione finale dello 0,02% p/v tricaina).
- Sciogliere una soluzione di agarosio al 2% in acqua bidistillata (ddH2O) utilizzando un forno a microonde. Versare l'agarosio fuso in un piatto di plastica. La capsula in plastica rivestita di agarosio al 2% può essere conservata a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
- Utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per trasportare le larve anestetizzate al centro del piatto di plastica rivestito di agarosio al 2%. Orientare le larve montate con il cervello rivolto verso l'alto per l'accesso all'ago.
3. Iniezione del ventricolo cerebrale
- Regolare l'ingrandimento del microscopio in modo che la struttura ventricolare cerebrale del pesce zebra sia chiaramente visualizzata nel campo visivo (Figura 1B).
- Posizionare con cautela l'ago sopra il tettone cerebrale (Figura 1C).
- Perforare lentamente la pelle del cervello del pesce zebra con la punta dell'ago utilizzando il micromanipolatore.
- Premere il pedale per espellere 1 nL di 1x PBS o diverse concentrazioni di LPS (1,0, 2,5 e 5,0 mg/mL) (vedere la Tabella dei materiali). Le immagini di iniezione del ventricolo riuscite in cui il ventricolo cerebrale è stato iniettato con 1 nL di colorante blu di Evans all'1% (diluito in PBS) sono mostrate come esempio (Figura 1D). Trasferire le larve in acqua d'uovo pulita (E3) subito dopo l'iniezione. Dopo 24 ore, raccogliere le larve per l'imaging microscopico, il test comportamentale della locomotiva e la determinazione di altri indicatori.
