Modellazione della morte neuronale indotta da specie reattive dell'ossigeno nei neuroni dei granuli cerebellari di topo

1. Preparazione sperimentale

NOTA: Le seguenti soluzioni stock possono essere preparate e mantenute fino all'uso.

1. Soluzione di dissezione
   1. Sciogliere 3,62 g di cloruro di sodio (NaCl), 0,2 g di cloruro di potassio (KCl), 0,069 g di fosfato di sodio (NaH₂PO₄ ∙ H₂O) e 1,306 g di D-(+)-glucosio in 500 ml di H₂O distillato. Quindi, aggiungere alla soluzione 12,5 ml di tampone HEPES, 450 μl di soluzione di rosso fenolo e 20 ml di albumina sierica bovina (BSA) frazione V. Regolare a pH 7,4 utilizzando 1 N di idrossido di sodio (NaOH).
   2. Sterilizzare con un filtro da 0,22 μm e conservare a 4 °C. Questa soluzione rimarrà stabile per un massimo di una settimana o 10 giorni.
2. tripsina
   1. Preparare una soluzione madre alla concentrazione di 25 g/L di tripsina in cloruro di sodio allo 0,9%. Conservare la soluzione a -20 °C.
3. Inibitore della tripsina
   1. Preparare un brodo con una concentrazione di 10 mg/mL sciogliendo 1 g di inibitore della tripsina dell'albume d'uovo di gallina in 100 mL di 1 mM HCl. Conservare questa soluzione a -20 °C.
4. Desossiribonucleasi (DNasi)
   1. Sciogliere 100 mg di DNasi 1 in 10 mL di acqua sterile per generare una riserva di 10 mg/mL. Conservare la soluzione a -20 °C.
5. MgSO₄
   1. Aggiungere 6,02 g di solfato di magnesio (MgSO₄) a 50 ml di acqua distillata (H₂O) per generare una riserva di 1 M. Conservare la soluzione a 4 °C.
6. CaCl₂
   1. Sciogliere 0,735 g di cloruro di calcio (CaCl₂∙ 2H₂O) in 50 mL di H₂O distillato a una concentrazione madre di 100 mM. Conservare la soluzione a 4 °C.
7. Kcl
   1. Sciogliere 3,7275 g di KCl in 50 mL di H₂O distillato fino a una concentrazione madre di 1 M. Conservare la soluzione a 4 °C.
8. D-(+)-glucosio
   1. Sciogliere 1,802 g di D-(+)-glucosio in 50 mL di H₂O distillato a una concentrazione stock di 100 mM. Conservare la soluzione a 4 °C.
9. Terreni di coltura cellulare
   1. Preparare i terreni di coltura cellulare come segue: 5 mL di siero fetale bovino dializzato inattivato termicamente, 500 μL di 200 mM di L-glutammina, 100 μL di 50 mg/mL di gentamicina e 1 mL di 1,0 M KCL devono essere aggiunti a 45 mL di terreno minimo essenziale (E-MEM) sterilizzato con filtro integrato con 1,125 g/L di D-glucosio per generare 50 mL di terreno di coltura di neuroni granulari cerebellari (CGN). Conservare i fluidi a 4 °C.
10. Citosina Beta-D-Arabino Furanoside
    1. Sciogliere 48 mg di citosina beta-D-arabino furanoside in 10 mL di terreno di coltura a una concentrazione stock di 20 mM. Conservare la soluzione a -20 °C.
11. Poli-D-lisina
    1. Per generare uno stock di poli-D-lisina da 2 mg/mL, aggiungere 10 mL di H₂O sterile a 20 mg di poliD-lisina. La poli-D-lisina madre deve essere conservata a -80 °C in aliquote da 100 μL.
       nota: Le seguenti soluzioni devono essere preparate prima della dissezione e mantenute a 4 °C fino all'uso.
12. MgSO₄ Soluzione di dissezione integrata
    1. Aggiungere 300 μL di MgSO₄ a 250 mL di soluzione di dissezione.
13. Soluzione di dissezione della tripsina
    1. Aggiungere 100 μL di tripsina madre e 12 μL di MgSO madre da₄ a 10 mL di soluzione di dissezione.
14. Soluzione inibitrice della tripsina 1
    1. Aggiungere 164 μL di inibitore della tripsina originale, 250 μL di DNasi 1 e 12 μL di MgSO 4 a 10 mL di soluzione di dissezione.
15. Soluzione di inibitore della tripsina 2
    1. Aggiungere 1040 μL di inibitore della tripsina originale, 750 μL di DNasi 1 e 12 μL di MgSO₄ a 10 mL di soluzione di dissezione.
16. Soluzione di dissezione integrata CaCl₂
    1. Aggiungere 10 μL di CaCl₂ e 25 μL di MgSO₄ a 10 mL di soluzione di dissezione.
17. Piastre di coltura rivestite in poli D-lisina
    1. Per rivestire le piastre di coltura, diluire 100 μL di poli-D-lisina madre in 40 mL di H₂O sterile. Per le piastre di coltura Nunc da 35 mm, aggiungere 2 mL di soluzione diluita di poli-D-Lisina. Per piastre a 4 pozzetti, aggiungere 300 μl di poliD-lisina diluita a ciascun pozzetto.
    2. Lasciare riposare la poli-D-lisina per 1 ora prima di aspirare e lavare ogni pozzetto con 4 mL o 600 μL (rispettivamente per piastre di coltura da 35 mm o piastre a 4 pozzetti) di H₂O sterile. Aspirare quindi l'H₂O e lasciare asciugare le stoviglie all'aria per 1 ora.

2. Estrazione del cervello e isolamento del cervelletto

1. Decapita un cucciolo di topo di 6-7 giorni usando le forbici per decapitazione. Eseguire la dissezione del cervello in una cappa di coltura di tessuti sterili.
2. Per rimuovere il cervello, afferrare la testa usando un paio di pinze e tagliare la pelle verso la parte anteriore della testa usando le forbici da microdissezione come mostrato nella Figura 1. Quindi taglia l'osso del cranio usando un nuovo paio di forbici per ridurre al minimo il rischio di contaminazione. Rimuovi il cranio che copre il cervello usando una pinza e stuzzica il cervello usando una pinza o una spatola.
   1. Se necessario, tagliare il nervo ottico per facilitare l'estrazione del cervello nel suo insieme.
3. Posizionare il cervello nella soluzione di dissezione, che è integrata con MgSO₄. Mantieni la soluzione e il cervello in ghiaccio.
4. Dopo la rimozione del cervello, al microscopio da dissezione, sezionare il cervelletto dal cervello mentre è ancora nella soluzione di dissezione integrata con MgSO₄ e rimuovere le meningi utilizzando una pinza fine. Ruotare il cervelletto verso il lato ventrale e assicurare la rimozione del plesso coroideo.
5. Raggruppare il cervelletto in una piastra da 35 mm contenente ~1 mL di soluzione di dissezione integrata con MgSO₄.
6. Tagliare il tessuto in piccoli pezzi e trasferirlo in una provetta da 50 mL contenente 30 mL di soluzione di dissezione tamponata MgSO₄.

3. Isolamento e coltura dei neuroni dei granuli cerebellari di topo

1. Centrifugare la provetta da 50 ml contenente il tessuto cerebrale tritato per 5 minuti a 644 x g e 4 °C.
2. Rimuovere il surnatante e aggiungere 10 mL di soluzione di dissezione di tripsina. Quindi, agitare il tubo ad alta velocità per 15 minuti a 37 °C.
3. Aggiungere 10 mL di soluzione inibitrice della tripsina 1 alla provetta e agitare delicatamente per 2 minuti.
4. Centrifugare la provetta per 5 minuti a 644 x g e 4 °C.
5. Rimuovere il surnatante e aggiungere 2 ml di soluzione inibitrice della tripsina 2, quindi trasferire in una provetta da 15 ml.
6. Triturare il tessuto nella provetta da 15 ml fino a quando la soluzione diventa torbida. Lasciate quindi riposare per 5 min.
7. Rimuovere il surnatante limpido e trasferirlo in una nuova provetta contenente 1 mL di soluzione di dissezione integrata con CaCl₂.
8. Aggiungere un altro mL di soluzione inibitrice della tripsina 2 sul fondo della provetta contenente il pellet del passaggio 3.6. Triturare nuovamente e lasciare riposare per 5 min. Rimuovere il surnatante e aggiungerlo al tubo contenente il surnatante del passaggio 3.7 (che è una ripetizione dei passaggi 3.6-3.7). Ripetere questo processo fino a quando la maggior parte del tessuto non è dissociata meccanicamente.
9. Aggiungere 0,3 mL di soluzione di dissezione integrata con CaCl₂ alla raccolta del surnatante per ogni mL di surnatante.
10. Mescolare il contenuto della provetta e centrifugare per 5 minuti a 644 x g.
11. Rimuovere il surnatante e aggiungere 10 ml di terreno fresco al pellet e mescolare.
12. Le cellule possono quindi essere contate e diluite a una concentrazione di 1,5 x 10⁶ cellule/mL. Si noti che in generale ci si aspetta 10 milioni di cellule da ogni cervello sezionato, a seconda del tempo di tripsinizzazione e dell'efficienza della dissezione. Celle a piastre su piastre di poli-D-lisina precedentemente realizzate. Per piastre a 4 pozzetti, piastra da 0,5 mL, fornendo 7,5 x 10⁵ celle per pozzetto. Per piastre da 35 mm, piastra da 4 mL, somministrando 6 x 10⁶ celle per piastra.
13. Dopo 24 ore, aggiungere citosina-β-arabino furanoside (AraC) alle piastre per ridurre la contaminazione gliale. Per ogni mL di terreno sono necessari 0,5 μL di 20 mM di AraC. L'aggiunta di AraC non richiede un cambio di supporto. Se le cellule devono essere mantenute per 7-8 giorni, ripetere questo trattamento il giorno 3.
14. Conservare le colture in un incubatore al 5% di CO₂ a 37 °C e somministrare 100 μL di glucosio 100 mM aggiunti alla coltura per ogni 2 mL di terreno ogni 2 giorni negli ultimi 5 giorni. Non è necessario un cambio completo del supporto.

4. Modellazione della lesione neuronale

1. Per indurre la morte cellulare indotta dai ROS (stress ossidativo), trattare i neuroni con 75-100 μM di perossido di idrogeno (H₂O₂) e passare a terreni condizionati da colture parallele dopo 5 minuti di esposizione a H₂O₂. Si noti che, a causa dell'instabilità di H₂O₂, ottimizzare la concentrazione a un livello che induca il 50-70% di morte cellulare in coltura dopo 24 ore di trattamento (Figura 2).

Figura 1: Rimozione del cervello del topo e dissezione del cervelletto. (A) Per estrarre il cervello di un topo di 6-7 giorni, usando un paio di pinze, afferrare la testa e tagliare la pelle anteriormente lungo le linee tratteggiate usando un paio di forbici da microdissezione. Fai attenzione a tagliare solo la pelle e il tessuto connettivo, un'incisione troppo profonda potrebbe perforare il cranio e danneggiare il cervello. Queste tre incisioni, diritte lungo la linea mediana e due curve lateralmente, consentono di spingere indietro la pelle rivelando il cranio. Una volta esposto, il cranio può essere penetrato con la punta delle forbici e tagliato anteriormente. Bisogna fare molta attenzione a non danneggiare il cervelletto per facilitare l'identificazione e la rimozione delle meningi. Una volta tagliato, il forcipe può essere utilizzato per staccare il cranio, esponendo il cervello che può quindi essere estratto in una soluzione di dissezione fredda utilizzando un paio di pinze o una spatola. Per rimuovere il cervello, potrebbe essere necessario recidere il nervo ottico. (B) Una volta rimosse dal cranio, le meningi devono essere rimosse dal cervelletto utilizzando un paio di pinze a punta fine. (C) Utilizzando un paio di pinze a punta fine, il cervelletto viene sezionato dal tessuto rimanente e ispezionato per garantire la completa rimozione delle meningi.

Figura 2: Modellazione del danno neuronale nei neuroni dei granuli cerebellari. I topi isolati del cervelletto del giorno 6-7 vengono dissociati in singole cellule seguendo la procedura presentata nella parte 3. Dopo la dissociazione, le cellule vengono contate e risospese in un volume di terreno di coltura per generare 1,5 x 106 cellule/mL.Per piastre da 35 mm, vengono piastrate 4 mL, ottenendo 6 x 106 cellule per piastra. Per i vetrini di imaging, vengono piastrate 0,5 mL, che danno 7,5 x 105 cellule/pozzetto. I CGN possono quindi essere trasdotti con lentivirus o infettati con adenovirus. L'uso dell'adenovirus il giorno della placcatura (0 giorni in vitro (DIV)) offre un'efficienza di trasfezione superiore al 90% e consente lo studio del danno neuronale attraverso lo stress ossidativo e il danno al DNA. L'aggiunta di 10 μM di camptotecina (CPT) indurrà danni al DNA, mentre 75-100 μM di perossido di idrogeno (H2O2) indurranno stress ossidativo. La concentrazione di H2O2 deve essere ottimizzata per indurre il 50% di morte cellulare dopo 24 ore. L'infezione con adenovirus a 5 DIV dà un'efficienza di trasduzione inferiore al 10%. A 7 DIV, quando i recettori NMDA sono arricchiti nella coltura, i neuroni possono essere trattati con 100 μM di NMDA e 10 μM di glicina per indurre eccitotossicità. Questo è l'ideale per successive analisi di imaging o per tracciare un singolo neurone. Infine, la trasduzione con lentivirus a 0 DIV, seguita dal trattamento con 100 μM di NMDA e 10 μM di glicina a 7 DIV, fornisce un'efficienza di trasduzione sufficientemente elevata (>80%) da consentire l'analisi biochimica della coltura, compreso il sequenziamento ChIP, l'esame dell'espressione proteica e l'esecuzione di saggi vivi/morti.