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Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Immunoistochimica
- Colorazione analogica della timidina
- Posizionare le sezioni di tessuto in PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) e montare 5-8 sezioni su un vetrino caricato positivamente, mantenendo l'ordine seriale da anteriore a posteriore e lo stesso orientamento. Lasciare asciugare le sezioni di tessuto per aderire completamente ai vetrini, quindi disegnare un bordo utilizzando una penna idrofobica o una penna PAP.
- Permeabilizzare le sezioni con tampone di permeabilizzazione (0,5% TBS (soluzione salina tamponata tris) -tritone) per 20-30 min. Quindi lavare le sezioni 2 volte con TBS-triton per 5 minuti ciascuna.
NOTA: La permeabilizzazione favorisce la penetrazione intracellulare degli anticorpi. Il tempo di permeabilizzazione può essere regolato in base allo spessore del tessuto e all'efficienza degli anticorpi. In alternativa, è possibile aumentare la concentrazione di detersivo per aumentare la potenza di permeabilizzazione. Tuttavia, è necessario prestare attenzione a non permeabilizzare troppo a lungo poiché la fragilità dei tessuti aumenta con il tempo di permeabilizzazione prolungato.
- Preparare la soluzione di reazione Edu (5-etinil-2'-desossiuridina) secondo la Tabella 1. La concentrazione finale di Alexa488-azide è di 15 μM in 1 mL di soluzione di reazione Edu.
- Incubare le sezioni nella soluzione di reazione Edu per 30 minuti - 1 ora e poi lavare 3 volte in TBS-triton per 5 minuti ciascuna. Dopo questo passaggio, coprire gli scivoli con un foglio di alluminio per proteggerli dalla luce. A questo punto, controlla se la reazione Edu funziona utilizzando un microscopio a fluorescenza. Le cellule marcate con Edu saranno fluorescenti sotto un microscopio a epifluorescenza.
- Protocollo di sezione di tessuto montato
- Bloccare le sezioni di tessuto montate su un vetrino dal passaggio 1.1.4 utilizzando un tampone bloccante allevato negli stessi animali dell'anticorpo secondario, ad es. siero d'asino, per 30 minuti a 1 ora e quindi lavare 2 volte in TBS-tritone per 5 minuti ciascuno.
- Preparare la soluzione di anticorpi primari (cioè anti-nestina di pollo) durante la fase di blocco mescolando gli anticorpi primari in una soluzione tampone bloccante a 1:200. 250 μl per vetrino sono sufficienti per garantire che il tessuto sia completamente immerso nella soluzione.
- Incubare sezioni di tessuto in una soluzione di anticorpi primari durante la notte a RT dopo aver bloccato i lavaggi. Modificare questo passaggio in base all'anticorpo primario utilizzato.
nota: Se gli anticorpi hanno un elevato background o un legame aspecifico, l'incubazione a 4 °C invece che a RT (temperatura ambiente) può migliorare i risultati. Gli anticorpi con scarsa penetrazione nei tessuti possono essere lasciati incubare per 2 giorni, se necessario.
- Incubare sezioni di tessuto 3 volte in TBS-triton per 5 minuti per rimuovere l'eccesso di anticorpi primari. Quindi, incubare sezioni di tessuto in anticorpi secondari coniugati con fluorofori (ad es. Alexa 647 anti-pollo a 1:200) preparati in soluzione tampone bloccante per 2 ore a RT.
- Incubare sezioni di tessuto 3 volte in TBS-tritone per 5 minuti per rimuovere l'anticorpo secondario in eccesso e applicare 300 μM di soluzione DAPI (4',6-diamidino-2-fenilidolo) a 1:100 in PBS per 15 minuti a RT.
- Incubare le sezioni di tessuto 3 volte in PBS per 5 minuti per rimuovere il DAPI in eccesso e rimuovere il cerchio della pap pen intorno al tessuto utilizzando un batuffolo di cotone o una salvietta delicata. Lasciare asciugare le sezioni, quindi applicare il supporto di montaggio e il vetrino coprioggetti. Lasciare asciugare i supporti di montaggio prima di acquisire immagini di diapositive.
Tabella 1: Soluzioni utilizzate per l'immunoistochimica
| Soluzione antigelo | Glicole etilenico 150 mL + saccarosio 150 g + riempire a 500 mL 0,1 M PB per 500 mL di soluzione |
| Tampone citrato | 9 mL di brodo di acido citrico + 41 mL di tampone citrato trisodico + 450 mL di ddH2O |
| Stock di acido citrico | [0,1 M] Acido citrico 21 g/1 L ddH2O |
| Stock di citrato trisodico | [0,1 M] Citrato trisodico 29,4 g/1 L ddH2O |
| Tris Soluzione salina tamponata -Triton (TBS -Triton) | 0,05% 100-x Triton in TBS |
| Tampone di permeabilizzazione | 0,5% 100-x Triton in TBS |
| Buffer di blocco | 0,33 mL di siero d'asino in 10 mL di TBS-Triton |
| Soluzione di reazione Edu | Preparare una soluzione di CuSO4.5H 2O aggiungendo 1 mg di CuSO4.5H 2O in 4 mL di soluzione di [0,1 M] Tris pH 8,5. Quindi aggiungere 1:40 di una soluzione di Alexa488-azide da 600 μM e 10 mg/mL di ascorbato L-Na+ alla soluzione CuSO4·5H2O prima di applicarla sul tessuto. |